葡萄酒产业副产品作为水开菲尔调味剂的价值化：微生物活力与功能特性

《Frontiers in Nutrition》：Valorization of wine industry by-products as a flavoring agent in water kefir: microbiological viability and functional properties

　　

为实现葡萄酒产业副产品的资源化利用，研究人员开发了一种以葡萄果渣（Vitis labrusca）调味的新型功能性水开菲尔饮料，并对其理化特性、微生物学特性及感官属性进行了系统评价，同时采用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）模型评估了其功能特性。研究设置了四组处理：0%（KC）、25%（K25）、37.5%（K37.5）及50%（K50）葡萄果渣添加量。结果表明，花青素（Anthocyanin）和总酚（Total Phenolic）含量呈剂量依赖性增加，在K50组达到峰值（分别为33.56 mg·L^?1和4.31 mg·g^?1）。在21天冷藏贮存期间，还原糖含量下降，pH由4.3降至3.5，酸度同步升高（最高达6.60%），反映了持续的微生物代谢活性。鉴于K37.5和K50组存在过度酸化及不良余味问题，研究选定K25配方进行后续生物学验证与感官评价。K25组中酵母（Yeast）和醋酸菌（Acetic Acid Bacteria, AAB）维持高活力（10⁷ CFU·mL^?1），而乳酸菌（Lactic Acid Bacteria, LAB）因葡萄果渣的选择性压力低于10⁵ CFU·mL^?1。K25组感官接受度指数达76.11%，购买意愿为65%。上述结果表明，25%葡萄果渣调味水开菲尔是一种可行的益生菌载体，富含生物活性化合物且具有良好感官吸引力。

本研究旨在将葡萄酒产业副产品葡萄果渣资源化为水开菲尔调味品，开发兼具功能性与商业可行性的非乳益生菌饮料，论文发表于《Frontiers in Nutrition》。

研究背景与问题：葡萄果渣（Grape Pomace, GP）是葡萄酒及果汁工业的重要残留副产品，由压榨后的种子、果皮及果肉组成，全球年产量巨大且处置困难。以巴西为例，2023年固体葡萄废弃物产量估计达378,319吨，其中大量未得到妥善处理。将此类废弃物再利用为原料符合联合国可持续发展目标（Sustainable Development Goals, SDGs），有助于实现循环经济与零废弃生产。与此同时，消费者对"天然、功能性及清洁标签产品"的偏好日益增长，非乳发酵饮料市场迅速扩张。然而，利用非常规底物（如葡萄果渣）进行水开菲尔（Water Kefir, WK）工业化生产面临重大挑战：水开菲尔共生菌群对规模变化、质量传递及剪切应力高度敏感，易导致代谢漂移；农业工业副产品的季节性变异影响发酵动力学；控制发酵终点以防止装瓶后酸化及二次CO₂积累，同时在非热杀菌条件下维持益生菌活力（10⁶–10⁷ CFU/mL）是确保产品货架期稳定性与感官标准化的关键瓶颈。此外，功能性食品的动物模型评估受伦理限制及高成本制约。基于上述背景，研究人员假设葡萄果渣中剩余的 fermentable compounds 及高浓度生物活性物质（如多酚）可作为水开菲尔粒的有效底物，产出具有增强理化稳定性、且在贮存期间维持足量益生菌活力的非乳益生菌饮料。

研究设计与结论：研究设置0%、25%、37.5%和50%四个葡萄果渣添加组，系统评价理化特性、微生物活力、感官接受度及秀丽隐杆线虫模型功能特性。结果显示，酚类及花青素含量呈剂量依赖性增加，但高浓度组（K37.5、K50）因过度酸化及不良余味被判定不可行。K25组被选为最优配方，其酵母和醋酸菌维持高活力（10⁷ CFU·mL^?1），乳酸菌因选择性压力低于10⁵ CFU·mL^?1。K25在秀丽隐杆线虫模型中未显示毒性，不影响基本生存过程及脂质积累，但亦未观察到延长寿命的geroprotective效应。感官接受度达76.11%，购买意愿65%。研究确立了葡萄酒副产品用于益生菌载体的技术基础，但指出实现完全产品标准化（货架期及酒精含量控制）仍是商业规模化的关键前提。

关键技术方法：研究采用Pinot Noir葡萄果渣（采自巴西Mato Grosso州Chapada dos Guimar?es地区Locanda do Vale酒庄），经均质、巴氏杀菌（80°C，5 min）制备提取物；水开菲尔发酵采用两段式工艺，第一段好氧发酵（25°C，24 h），第二段厌氧发酵（25°C，12 h）以自然碳酸化；冷藏贮存期间（2–4°C）于1、7、14、21天取样进行理化和微生物分析。主要技术手段包括：总酚含量（Folin–Ciocalteu法）、单体花青素（pH示差法）、抗氧化活性（DPPH自由基清除能力及FRAP铁离子还原能力法）、还原糖（Somogyi–Nelson法）、微生物计数（平板涂布法，选择培养基分别培养醋酸菌、酵母和乳酸菌）、主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）及感官评价（9点快感标度法）。功能评价采用秀丽隐杆线虫N2野生型及fem-1(hc17)突变体BA17品系，检测氧化应激（3 mM H₂O₂）、热应激（35°C休克）、寿命及脂肪积累（Oil Red O染色法）指标。

研究结果：

**理化特性、酚类化合物及抗氧化活性：** 葡萄果渣添加提高了饮料总固形物、灰分及可溶性固形物含量，降低水分含量。pH随果渣浓度增加而降低（对照4.3至K50的3.7），可滴定酸度相应升高，这与有机酸的持续产生有关。总酚含量（Total Phenolic Content, TPC）、花青素及抗氧化活性（DPPH和FRAP）均呈剂量依赖性增加，K50组TPC达4.31±0.06 mg·mL^?1，为对照的5.8倍。此现象源于葡萄皮中约60–70%酚类化合物残留于果渣，以及水开菲尔菌群（包括乳酸菌）对复杂酚类的水解作用，释放结合态酚类并形成新的抗氧化衍生物。

**冷藏贮存期间的理化稳定性：** pH和酸度受果渣浓度和贮存时间双重影响，随贮存持续下降（对照组4.3→3.9，K25组3.85→3.60）。可溶性固形物在首周显著下降，反映残留糖的持续消耗。还原糖呈现先升后降趋势：初期酵母快速水解蔗糖为葡萄糖和果糖导致还原糖暂时升高，后期微生物代谢消耗使其降低。总酚和花青素含量在贮存前10天上升后下降，这与初期微生物酶解细胞壁释放多酚、后期降解及聚合作用有关。主成分分析显示91.01%的变异可被解释，高浓度组与花青素、酚类及还原糖高值相关，且K37.5与K50终点特性相似。高酸度及葡萄籽颗粒导致的收敛性余味使K37.5和K50被判定不可行，K25被选为最优配方进行后续验证。

**秀丽隐杆线虫功能试验：** 氧化应激（H₂O₂）和热应激（35°C）条件下，K25与对照组生存曲线无显著差异（Log-rank Mantel–Cox, p=0.2672及p=0.1722），表明产品不损害模型生物的应激抵抗能力。寿命试验中，K25组（25±1.3天）、对照组（28±2天）及K培养基组（25±0.5天）无统计学差异（p=0.1904），未显示延长寿命效应，可能与缺乏DAF-16/FOXO和p38-MAPK/SKN-1通路调节活性有关，但确认了产品的生物学安全性。脂肪定量分析（Oil Red O染色，校正总细胞荧光法CTCF）显示K25与对照组无显著差异，表明产品不影响模型生物脂质平衡。

**贮存期间微生物活力：** K25组醋酸菌维持高活力（10⁷ CFU·mL^?1），该菌群在酸性环境中被选择性富集，成为驱动最终理化特性的主要菌群。酵母初始计数高（2.1×10⁷ CFU·mL^?1），贮存中期下降后于第21天部分恢复，可能与累积乙酸毒性及乙醇含量有关，也可能与果渣基质中缓慢水解释放的复杂营养有关。乳酸菌持续受抑（<10⁵ CFU·mL^?1），主因是酚类及花青素的抗菌活性、与酵母的竞争性抑制以及酸性环境胁迫。

**感官接受度与购买意愿：** 微生物安全性符合巴西现行法规标准。120名未经培训评价者参与测试，其中58.33%不习惯消费非酒精发酵饮料。K25总体接受度76.11%，平均评分6.85±1.58；纹理属性评分最高（7.65±1.23），62%评价者表示非常喜欢。购买意愿方面，35.8%评价者不确定、30%可能购买、13.3%肯定购买，43.3%表达明确购买意向。

讨论与结论总结：葡萄果渣的添加显著改变了水开菲尔发酵生态系统，增加了酚类和花青素等生物活性化合物浓度，提升了抗氧化活性。较高浓度（37.5%和50%）导致过度酸化和稳定性降低；因此，25%配方（K25）被确定为最适添加量，维持了高微生物计数（10⁷ CFU·mL^?1）。葡萄果渣作为微生物演替途径的选择性驱动因子，有利于耐酸醋酸菌而抑制乳酸菌和酵母活力。在生物学安全性方面，K25饮料在秀丽隐杆线虫模型中不损害基本生存过程或改变脂质积累，虽未观察到基础条件下的长寿保护效应，但确认了产品的代谢安全性。感官分析显示K25接受度良好（76%），即使对于不习惯非酒精发酵饮料的消费者亦如此，证明了其商业可行性。尽管单一来源残留物的使用构成局限，本研究为葡萄酒副产品用于益生菌载体奠定了基础。虽然该产品显示出有前景的功能和感官特性，但实现货架期和酒精含量控制的完全标准化仍是商业规模化的关键先决条件。共生菌群的固有代谢动态性对工业化规模稳定化构成挑战，因为持续的装瓶后发酵会随时间改变挥发性特征和乙醇浓度。未来研究需评估葡萄果渣的季节稳定性及化学一致性，以确保不同生产批次的发酵动力学均匀性；此外，虽线虫模型确认了K25配方在基础条件下的生物安全性，后续研究应采用体外胃肠消化模型调查酚类化合物的消化吸收后生物可及性和生物利用度，并结合氧化应激条件下关键代谢基因（如fat-7、sbp-1、aak-2）的表达分析，以建立完全标准化、货架稳定且商业可行的益生菌载体。