《Frontiers in Oncology》：Bulk and single-cell RNA sequencing data identified HMGB3 of chromatin regulators as a breast cancer biomarker associated with the cell cycle
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摘要
背景：既往研究表明，染色质调控因子（chromatin regulators，CRs）可在多种病理生理过程中调节肿瘤发生与进展，但其在乳腺癌（breast cancer，BRCA）中的作用及其与免疫微环境的关联仍知之甚少。
方法：本研究利用转录组测序
摘要
背景：既往研究表明，染色质调控因子（chromatin regulators，CRs）可在多种病理生理过程中调节肿瘤发生与进展，但其在乳腺癌（breast cancer，BRCA）中的作用及其与免疫微环境的关联仍知之甚少。
方法：本研究利用转录组测序数据和单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）数据鉴定BRCA中差异表达的CRs基因。研究人员采用蛋白质印迹法（Western blot）、Transwell实验及免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）探讨HMGB3基因的生物学功能。
结果：本研究鉴定出11个CRs，并据此构建了预后模型。根据风险评分中位数，将患者划分为高风险组和低风险组。基于该模型构建的列线图可较为准确地预测总生存期（overall survival，OS）。低风险患者具有更显著的免疫细胞浸润。IHC进一步证实HMGB3的表达水平与BRCA密切相关。体外功能实验表明，HMGB3通过调控细胞周期增强BRCA细胞侵袭能力，并促进恶性进展。
结论：基于CRs在BRCA中预后价值的生物信息学分析，本研究鉴定出HMGB3这一促进BRCA发生与发展的新型靶分子。
该文发表于《Frontiers in Oncology》，围绕乳腺癌（BRCA）中染色质调控因子（chromatin regulators，CRs）的预后价值及其与肿瘤免疫微环境的关系展开研究，并进一步聚焦HMGB3这一候选分子，结合多组学分析与体外实验验证其在乳腺癌进展中的作用。研究背景在于：乳腺癌仍是全球女性最常见恶性肿瘤之一，尽管免疫检查点抑制剂与抗体偶联药物等新疗法不断出现，但患者负担依旧沉重，早期诊断和预后评估标志物仍然不足。与此同时，表观遗传异常已被认为是肿瘤的重要特征，而CRs作为调控染色质结构与基因表达的关键蛋白群，在肿瘤发生发展中具有重要地位。但在乳腺癌中，CRs如何影响患者预后、如何与肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）尤其是免疫浸润模式相关，仍缺乏系统研究。因此，研究人员开展本研究，旨在识别与乳腺癌预后密切相关的CRs，建立风险分层模型，并从中筛选关键分子进行组织与细胞水平验证。
在技术路径上，研究主要结合了TCGA乳腺癌转录组与临床数据、GEO中的单细胞RNA测序队列GSE180286以及GSE42568表达队列，并整合差异表达分析、GO/KEGG富集分析、单因素与LASSO Cox回归、多因素Cox回归、列线图构建、ROC与C-index评估、CIBERSORT和GSVA免疫分析、单细胞聚类与拟时序分析等生物信息学方法；在实验验证层面，采用961医院病理科来源的肿瘤及邻近正常组织进行IHC检测，并在MDA-MB-231细胞中通过Transwell实验和Western blot分析HMGB3对侵袭及细胞周期相关蛋白的影响。
在结果部分，论文首先在“3.1 Identification of differentially expressed CRs in breast cancer samples”中报告：研究人员对TCGA中的1105例乳腺癌样本和112例癌旁乳腺样本进行差异分析，在870个CRs中鉴定出136个失调的CRs，其中57个下调、79个上调，提示CRs在乳腺癌中存在广泛表达重塑。
在“3.2 Enrichment analysis of GO and KEGG”中，GO与KEGG富集结果显示，这些差异CRs主要富集于组蛋白修饰、染色体重塑、细胞周期、赖氨酸降解及polycomb抑制复合体等相关过程和通路。该结果说明，乳腺癌中异常表达的CRs与染色质状态改变及细胞增殖调控密切相关，并从功能层面支持其参与肿瘤发生。
在“3.3 Construction of CRs prognostic model”中，研究人员采用单因素Cox回归筛选出13个与总生存相关的CRs，随后使用LASSO Cox回归和多因素Cox回归进一步收缩变量并建立模型，最终形成由11个基因组成的CRs预后风险模型：ASCL1、ERCC6L、HMGB3、IKZF3、KDM4B、PRDM11、PRDM12、PRDM16、RAD54B、SIRT7和TFF1。该模型为后续风险分层与临床预测奠定基础。
在“3.4 Prediction of the robustness of CRs prognostic model”中，依据中位风险评分将患者划分为高风险组和低风险组。结果表明，高风险组死亡数显著更多，Kaplan-Meier生存分析显示高风险患者总体生存显著较差。时间依赖ROC分析中，1年、3年和5年的AUC分别为0.709、0.687和0.660，说明该模型具有一定的预后预测能力。
在“3.5 Evaluation of prognostic model’s clinicopathological features”中，单因素分析提示风险评分、S分期、N分期、T分期及年龄与患者生存显著相关；多因素分析则显示风险评分和年龄仍具有统计学意义，提示该CRs特征可作为独立预后指标。研究人员进一步整合风险评分与临床病理分期构建列线图，用于量化1年、3年和5年生存概率，提高了模型的临床应用价值。
在“3.6 Evaluation of tumor-immune landscape and analysis of immune related function”中，研究重点分析了风险分层与免疫微环境的关系。结果显示，低风险组适应性免疫评分更高，提示高风险组可能存在更强的免疫逃逸。CIBERSORT分析表明，低风险组CD8
+ T细胞、活化CD4
+记忆T细胞、滤泡辅助性T细胞和M1型巨噬细胞浸润更多，而高风险组单核细胞和M2型巨噬细胞浸润更高。GSVA进一步显示，高风险组13项免疫功能中有10项下降，且低免疫反应与较差生存相关。同时，低风险患者在多数免疫检查点相关基因上得分更高，如CD274、PDCD1、CTLA4、TIGIT和LAG3，提示其可能更能从免疫检查点抑制剂治疗中获益。补充分析还发现高风险组具有更高的肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）。
在“3.7 Concurrent analysis of data from scRNA-seq”中，研究人员纳入GSE180286的5例乳腺癌患者单细胞转录组数据，共获得16,384个高质量单细胞。经标准化、PCA降维及t-SNE聚类后，细胞被划分为17个亚群，并使用Human Primary Cell Atlas进行注释。拟时序分析显示，恶性细胞沿伪时间轨迹呈现三种不同状态，早期细胞主要包括成纤维细胞、软骨细胞和内皮细胞，晚期细胞则以 epithelial cells（上皮细胞）为主，并伴有T细胞和巨噬细胞明显浸润。该结果从单细胞层面揭示了乳腺癌细胞组成与状态转变特征。
在“3.8 Combining bulk with scRNA-seq reveals important CRs.HMGB3 is linked to cell cycle”中，研究人员将11个预后模型基因与单细胞分析所得4,965个标志基因求交集，得到9个共表达CRs：ASCL1、ERCC6L、HMGB3、IKZF3、KDM4B、PRDM11、RAD54B、SIRT7和TFF1。其中特别值得注意的是，HMGB3和TFF1主要分布于Cluster 5上皮细胞中。进一步结合GEPIA分析发现，ERCC6L、HMGB3和TFF1在乳腺癌组织中较邻近非癌组织表达更高，而ERCC6L与HMGB3在预后上具有显著性。单基因GSEA显示，HMGB3高表达与细胞周期信号通路呈正相关，而与嗅觉和味觉信号转导呈负相关，提示HMGB3可能通过细胞周期通路参与乳腺癌进展。
在“3.9 Expression analysis of HMGB3 in BRCA”中，研究人员对HMGB3进行了组织和功能验证。IHC结果显示，HMGB3在乳腺癌组织中的表达显著高于邻近正常组织，这一结果与HPA数据库趋势一致；GSE42568数据分析同样支持HMGB3在乳腺癌组织中高表达。随后，研究人员在MDA-MB-231细胞中敲低HMGB3，Transwell实验显示细胞侵袭能力显著下降，提示HMGB3促进乳腺癌细胞侵袭。Western blot进一步检测细胞周期相关蛋白发现，在si-382和si-462转染组中，P27KIP1蛋白显著升高，而Cyclin D1蛋白显著降低。该结果说明HMGB3可能通过上调Cyclin D1并下调P27KIP1，促进细胞进入下一周期阶段，从而推动肿瘤细胞恶性进展。
讨论部分围绕HMGB3作为关键CRs分子的生物学意义展开。研究综合认为，乳腺癌中差异表达的CRs不仅与染色质重塑、组蛋白修饰和细胞周期等经典肿瘤生物学过程相关，而且与免疫浸润状态和免疫检查点表达密切相连，提示CRs相关特征既具有预后分层意义，也可能为免疫治疗获益评估提供线索。在此基础上，HMGB3被确定为最具代表性的关键基因之一。研究通过bulk RNA-seq与scRNA-seq并行分析锁定HMGB3主要富集于上皮细胞群，并通过组织和细胞实验验证其高表达及促侵袭作用。讨论还指出，HMGB3虽然在风险模型和单因素分析中表现出较好的预测价值，但在纳入传统临床病理因素后，其独立预后意义未达到统计学显著，这提示HMGB3可能与肿瘤分期或疾病进展具有内在联系，其临床价值更适合放在综合分层模型中理解。论文同时强调，本研究的创新之处不在于首次提出HMGB3与细胞周期相关，而在于从染色质调控视角系统识别该基因，结合单细胞数据进行并行确认，并通过Cyclin D1/P27KIP1通路完成在乳腺癌细胞中的机制层面验证。
研究结论部分可译为：乳腺癌CRs预后模型能够预测乳腺癌患者的预后；HMGB3被认为是值得在乳腺癌中进一步开展功能和治疗学研究的有前景候选分子；HMGB3促进乳腺癌细胞的增殖与侵袭，并且HMGB3可通过促进CyclinD1表达、抑制P27KIP1表达，推动细胞进入下一周期阶段。
总体而言，该研究构建了一个基于CRs的乳腺癌预后模型，并通过免疫微环境分析和单细胞转录组并行验证，将HMGB3确定为与细胞周期相关、促进乳腺癌进展的重要分子。该成果为理解乳腺癌表观遗传调控与免疫生态的联系提供了依据，也为后续开展HMGB3相关机制研究和临床转化探索提供了支持。
