《BMC Methods》：Three-dimensional single-cell imaging analysis of tumor-natural killer cell interaction dynamics in multi-cell-type tumor organoid models
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背景：患者来源的肿瘤类器官（patient-derived tumor organoids）已成为比传统癌细胞系和小鼠肿瘤模型更能生理相关地重现原发肿瘤架构与功能的模型。尽管有其优势，但建立包含肿瘤及肿瘤微环境（TME）关键非肿瘤组分的复杂类器官系统的标准化方
背景：患者来源的肿瘤类器官（patient-derived tumor organoids）已成为比传统癌细胞系和小鼠肿瘤模型更能生理相关地重现原发肿瘤架构与功能的模型。尽管有其优势，但建立包含肿瘤及肿瘤微环境（TME）关键非肿瘤组分的复杂类器官系统的标准化方案仍然有限，现有文献多聚焦于类器官-T细胞共培养。方法：研究人员在此提出一套详细且可重复的方案，用于生成类器官-自然杀伤（NK）细胞共培养模型，具体为一种三组分体系，包含患者来源肿瘤类器官、原代NK细胞和内皮细胞。该方案还包括一个三维（3D）活细胞成像工作流程，用于在单细胞水平可视化和定量NK细胞与肿瘤类器官之间的实时相互作用动力学。结果：应用该方案能够定量分析NK细胞介导的对不同肿瘤类器官亚型的细胞毒性，无论在内皮细胞存在与否的条件下均可进行。这些分析可揭示肿瘤微环境内不同的NK细胞敏感型、NK细胞抵抗型和NK细胞排斥型肿瘤表型。结论：该方案建立了一个稳健的三维共培养框架，用于在复杂肿瘤微环境中剖析NK细胞应答，支持免疫-肿瘤相互作用的机制研究，并为在患者特异性背景下评估基于NK细胞的免疫治疗提供了一个可行的临床前平台。
该研究发表在《BMC Methods》。研究背景方面，患者来源肿瘤类器官（patient-derived tumor organoids）虽能较好重现原发肿瘤架构与功能，且美国FDA已于2022年12月立法允许用人源类器官药物测试数据替代动物数据用于临床试验审批，但大多数模型仅含肿瘤上皮细胞，缺乏肿瘤微环境（TME）关键非肿瘤组分（如免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞），限制了其对细胞间互作及复杂信号的重现能力，难以用于免疫调节研究或癌症免疫治疗评估。目前构建多细胞肿瘤类器官主要有两种策略：原生（holistic）途径（培养完整肿瘤片段，保留内源性非肿瘤细胞但免疫细胞活力受限，培养时长约1?2个月）；重建（reconstitution/共培养）途径（将肿瘤类器官与外源性非肿瘤细胞体外组合，来源可为患者自身或健康供体、或工程化免疫细胞如CAR-T、CAR-NK，更灵活且适合长期分析）。现有共培养文献多集中于T细胞，肿瘤类器官-NK细胞共培养及相应三维单细胞动态成像方案仍较缺乏，因此研究人员开展了本研究以建立标准化多细胞类器官-NK细胞共培养体系与三维活细胞成像定量流程。
关键技术方法上，研究人员采用患者来源胃肿瘤类器官（样本为胃癌类器官生物样本资源）作为代表模型，分别用慢病毒携带H2B-mRFP（红色荧光核报告基因）标记肿瘤类器官、H2B-EGFP（绿色荧光核报告基因）标记人脐静脉内皮细胞（HUVEC），原代NK细胞从人外周血单核细胞（PBMC）经阴性选择富集获得并用CellTracker Deep Red（远红胞质活细胞染料）标记；共培养体系包括二组分（肿瘤类器官＋NK细胞）和三组分（肿瘤类器官＋HUVEC＋NK细胞，也可将内皮细胞替换为成纤维细胞），所有细胞在基底膜基质（如Geltrex）中进行三维共培养；成像采用转盘共聚焦显微镜（如Andor Dragonfly）进行长时间三维活细胞成像（典型参数：每帧4分钟、总时长8小时、30个z栈、步长3 μm、总深度90 μm，三通道分别对应mRFP、EGFP、Deep Red），所得三维时间序列图像采用基于深度学习的SiQ-3D（Single-cell image Quantifier for 3D）软件进行分割、表型分类和单细胞追踪以提取动态数据。
研究结果部分，Expected results（预期结果）：三维时间序列成像数据表明，通过独特荧光标记可同时可视化并定量复杂肿瘤类器官内不同细胞类型的动态行为；经SiQ-3D等工具处理可实现图像分割、表型分类（如活/死肿瘤细胞、极化/非极化NK细胞）和细胞追踪，从而将体积图像转化为单细胞位置和表型轨迹；进一步共定位分析可识别各时间点与肿瘤类器官接触的NK细胞，统计接触数目与持续时间以揭示相互作用频率与持续性动力学；通过核报告基因（H2B-mRFP）监测肿瘤细胞核碎裂来定量肿瘤细胞死亡，确定从初始NK-肿瘤接触到肿瘤死亡的杀伤时间（kill time）；单细胞追踪可捕获NK细胞迁移及趋向肿瘤的模式，从而刻画NK细胞迁移、肿瘤浸润、共轭形成和细胞毒杀伤的连续动力学步骤。具体量化案例显示：在无内皮细胞时，肠型亚型胃肿瘤类器官（GX068-TO）表现为NK细胞抵抗（接触少且多为瞬时，8小时肿瘤细胞死亡比例低），微卫星不稳定亚型（GX048-TO）表现为NK细胞敏感（频繁长效接触，>30分钟，8小时>30%肿瘤细胞被清除）；当在三组分模型中于GX048-TO表面形成HUVEC层时，内皮屏障使NK细胞浸润和接触减少五倍以上，NK-肿瘤或NK-内皮接触大多短暂（<10分钟），无肿瘤细胞死亡，重现了“NK细胞排斥（NK cell-excluded）”表型，说明内皮层可作为物理/信号屏障阻碍NK细胞迁移与浸润，降低细胞毒活性。
讨论与结论部分翻译如下：该方案建立了稳健的三维共培养框架，用于在复杂肿瘤微环境中剖析NK细胞应答；它支持免疫-肿瘤相互作用的机制研究，并为在患者特异性背景下评估基于NK细胞的免疫治疗提供了一个可行的临床前平台。研究人员还指出方案的局限性包括：荧光标记方面，肿瘤类器官易用慢病毒稳定表达核荧光报告（如H2B融合蛋白）以利三维图像分割，但正常类器官慢病毒转导效率较低可能需用电穿孔等替代方法；原代免疫细胞基因修饰易改变表型功能，故用胞质活细胞染料（如CellTracker）标记NK细胞，避免核染料长期活细胞成像的细胞毒性；若细胞无法有效荧光标记，可考虑无标记三维成像（如全息断层成像holotomography）但分辨率和灵敏度低于荧光共聚焦。显微镜系统与光毒性方面，原代免疫细胞（尤其NK细胞）对光毒性敏感，需用高灵敏度共聚焦（如转盘共聚焦）以最小化激光激发同时维持足够荧光信号可靠检测与追踪；成像参数（时长、帧率、z栈数、荧光强度）需根据实验目标和共培养系统动态特性优化，只要信噪比≥2，SiQ-3D即可正确识别与分割单细胞轨迹。总体而言，该文提出的多细胞肿瘤类器官共培养与三维单细胞活细胞成像定量流程，可表征复杂肿瘤微环境中NK细胞-肿瘤相互作用动力学，鉴定敏感、抵抗及排斥表型，为合理设计联合免疫治疗（如NK细胞疗法联合免疫检查点阻断或抗血管生成治疗）提供新途径。
