circVDJ-seq用于单细胞及空间多组学中T细胞克隆型检测

《Genome Medicine》：circVDJ-seq for T cell clonotype detection in single-cell and spatial multi-omics

　　

监测人体组织中的T细胞受体(T cell receptor, TCR)库可为癌症、感染性疾病及自身免疫性疾病的免疫应答机制提供重要见解。然而，从采用cDNA 3'-条形码标记(barcoding)的单细胞及空间转录组学工作流程中获取可变(V)、多样性(D)、连接(J)基因片段(VDJ)信息仍依赖资源密集型方案或需专用测序设备。本文介绍一种名为circVDJ-seq的新方法，可从3'-导向工作流程[如单细胞或单细胞核RNA测序(RNA-seq)、ATAC+RNA多组学(multi-omics)及空间转录组学]中简便且经济高效地进行T细胞受体(TCR)谱分析。将circVDJ-seq应用于新鲜切除的神经母细胞瘤以及受肺炎或COVID-19影响的死后淋巴结，可揭示不同的免疫微环境及T细胞克隆性(clonality)模式，凸显了其在多种临床背景下的广泛适用性。

《Genome Medicine》论文解读：circVDJ-seq实现3'-导向单细胞与空间转录组的T细胞受体(VDJ)克隆型分析

一、研究背景与立项依据

抗原特异性T细胞是适应性免疫应答的关键介质，在自身免疫病、癌症及感染性疾病中发挥核心作用。T细胞的抗原特异性和克隆身份由T细胞受体(T cell receptor, TCR)决定，TCR通常由α/β或γ/δ异二聚体组成，其中α/β型最常见于CD4⁺辅助T细胞和CD8⁺细胞毒性T细胞。T细胞高度多样化的库(repertoire)由TCRA（编码α链）和TCRB（编码β链）基因位点的体细胞V(D)J重组产生，互补决定区3(complementarity-determining region 3, CDR3)直接接触主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)所提呈的抗原。目前常用的单细胞TCR谱分析多采用5'-条形码标记(5'-barcoded)的单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)策略，因为常规的3'-导向(3'-directed) scRNA-seq（如10× Genomics 3' Gene Expression assay）在片段化建库过程中会丢失位于TCR转录本5'端前约500 nt的VDJ序列信息，无法恢复VDJ。此外，先进的单细胞核多组学ATAC+RNA测序(Multiome ATAC+Gene Expression, MO)及空间转录组学平台（如10× Genomics Visium、Slide-seq）同样基于3'-barcoding of transcripts，也无法直接获得TCR VDJ信息。虽然近年已有研究尝试通过多重PCR靶向所有V片段或杂交捕获富集TCR cDNA分子来从3'-barcoded文库中回收VDJ，但这些方法通常需要数百条基因特异性引物、杂交捕获探针，有时还需长读长(long-read)测序设备，成本高且操作繁琐。因此，研究人员开发了circVDJ-seq（circularization-based VDJ sequencing），一种简化、低成本、仅需少量引物且兼容常规短读长(short-read)测序平台的TCR克隆型分析方法，适用于各类3'-导向scRNA-seq、单细胞核多组学及空间转录组cDNA文库。

二、主要关键技术方法

研究人员收集并处理多种人类临床样本：健康供体外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)、结直肠癌(colorectal cancer, CRC)新鲜组织、神经母细胞瘤(neuroblastoma, NB)高危(high-risk, HR)与低危(low-risk, LR)新鲜手术切除组织、COVID-19死者肺及肺引流淋巴结(lung-draining lymph node, dLN)以及非COVID-19肺炎死者淋巴结冰冻组织。并行构建10× Genomics 3'GEX v3.1 scRNA-seq文库、5' Immunoprofiling v2(5'IPv2) scRNA-seq文库、Single Cell Multiome ATAC+RNA(cDNA来自分离的单细胞核)文库及Visium空间转录组cDNA文库。从上述3'-barcoded cDNA文库中取1–15 ng进行circVDJ-seq建库：先用带同源末端的引子通过PCR给cDNA两端加同源序列，再用NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix将cDNA环化(circularization via Gibson assembly)，使VDJ区紧邻细胞条形码(cell barcode, CBC)和唯一分子标识符(unique molecular identifier, UMI)；Lambda外切酶去除残余线性DNA后，用靶向TCRα恒定区(TRAC)及TCRβ恒定区(TRBC1/TRBC2)和3'非翻译区(untranslated region, UTR)的引物进行巢式PCR(nested PCR)扩增VDJ片段，最终用10× 5'IPv2/3 TCR文库构建试剂盒进行片段化、末端修复、A尾添加、接头连接及双端索引PCR扩增，在Illumina平台测序。作为对照/验证，部分样本还进行了5'IPv2 TCR测序、MAS-ISO-seq长读长测序及基于杂交捕获的长读长空间VDJ(long-read Spatial VDJ, LR Spatial VDJ)测序。生物信息学分析方面：circVDJ-seq数据交换Cell Ranger对应条形码白名单(whitelist)后用Cell Ranger vdj流程比对至refdata-Cell Ranger-vdj-GRCh38-alts-ensembl-5.0.0，再用Dandelion(v0.3.7)进行再注释(reannotate_genes)以改进VDJ contig注释；部分数据也用MiXCR(v4.1.2)和TRUST4(v1.1.5)处理比较。空间转录组用Space Ranger(v1.3.0)比对GRCh38-2020-A，Seurat(v4.4.0)进行归一化、聚类和UMAP降维，TCR克隆型按空间条形码(spatial barcode, SBC)匹配至对应spot。克隆频率比较、共发生(co-occurrence)概率分析参照squidpy思路在R中实现，Index hopping用自定义过滤策略剔除。

三、研究结果

circVDJ-seq simplifies TCR profiling from 3'-barcoded cDNA libraries（circVDJ-seq简化3'-条形码化cDNA文库的TCR谱分析）

研究人员用已存档的MSI结直肠癌3'GEX v3.1 cDNA，以不同投入量进行circVDJ-seq。数据显示平均85% reads含有效CBC，65% reads比对到VDJ基因；不同投入量下鉴定出的CBC、CDR3序列及CBC+CDR3组合在技术重复间高度重叠。T细胞中平均68%检出TCRα contig、90%检出TCRβ contig，59% T细胞获配对αβ克隆型信息，灵敏度不受cDNA投入量影响。与金标准5'IPv2相比，circVDJ-seq虽总体回收克隆数略少（因5'端直接捕获设计更敏感），但共同扩增的克隆型在相同肿瘤不同细胞群中被可靠检出，克隆频率高度一致(R≈0.93)，证明circVDJ-seq可从有限存档cDNA中回顾性获取可信TCR克隆信息，且Cell Ranger结合Dandelion处理重复比单独用Cell Ranger、MiXCR或TRUST4重现性更好。

circVDJ-seq reliably detects TCR clonotypes from single cells and nuclei in multi-omics assays（circVDJ-seq可可靠检测多组学检测中源自单细胞及单细胞核的TCR克隆型）

同一健康供体PBMCs平行进行5'IPv2、3'GEX v3.1及Multiome(MO，单细胞核起始) assay并做circVDJ-seq。3'GEX与5'IPv2整体克隆回收率接近(87% vs 97%)，MO assay因单细胞核mRNA含量低于完整细胞导致TCRα contig回收减少，仅36% T细胞获克隆型赋值，但仍与5'IPv2共有部分高频克隆——5'IPv2前20高频克隆中分别有19个(3'GEX)和15个(MO)被circVDJ-seq回收，个体克隆丰度显著相关(R=0.93及R=0.78, 均P<2.2×10^?16)。经MAS-ISO-seq长读长无偏好测序同一MO cDNA验证，circVDJ-seq与MAS-ISO-seq克隆频率高度相关(R=0.84, P<2.2×10^?16)，排除circVDJ-seq流程本身引入偏差的可能。轻度多聚甲醛(parafomaldehyde, PFA)固定后行DOGMA-seq式MO处理再进行circVDJ-seq，TCR检出效率相当，表明该方法可与四模态(doRNA/ATAC/protein/线粒体变异)单细胞分析兼容。

Spatial circVDJ-seq detects T cell clonal expansion in autopsy-derived tissue（空间circVDJ-seq检测尸检组织中的T细胞克隆扩增）

对慢性COVID-19死者肺组织Visium cDNA做triplicate circVDJ-seq。Cell Ranger VDJ因spot barcode数少干扰UMI阈值判定未直接报告，但经Dandelion再处理可有效重构TCRα/β链及空间坐标。技术重复间SBC+CDR3组合高度一致，各聚类spot中检出TCR克隆的比例与该聚类Visium GEX中TCRα/β UMI计数正相关，高T细胞丰度见于浆细胞及肺泡spot，并与基质cluster 7、8邻近。一株具TCRβ CDR3氨基酸序列CASSHENQPQHF的克隆明显扩增。进一步分析同一队列急性、慢性、迁延性COVID-19及非COVID-19肺炎dLN的Visium cDNA，circVDJ-seq与LR Spatial VDJ检出的CDR3-SBC组合及克隆频率高度吻合，且circVDJ-seq回收TRA/TRB链数更多。COVID-19 dLN克隆扩增程度极低，而非COVID-19肺炎dLN（伴鳞癌转移可能）显示显著克隆性T细胞扩增，印证circVDJ-seq可从降解风险高的尸检材料分辨不同T细胞克隆动力学。

Spatial circVDJ-seq reveals differential T cell infiltration in high- and low-risk neuroblastoma（空间circVDJ-seq揭示高危与低危神经母细胞瘤差异性的T细胞浸润）

对MYCN非扩增的IV期高危(HR-)与4S期低危(LR-)神经母细胞瘤新鲜组织做Visium及duplicate circVDJ-seq。联合空间GEX分析鉴定出差异富集的肿瘤及基质/免疫细胞cluster：LR-NB肿瘤cluster高表达PRPH、NRCAM及预后良好相关基因(CCNL2、WSB1、PCBP4、HAND2-AS1)，HR-NB主肿瘤cluster 2低表达神经元分化标记、高表达NPY和NEAT1（与不良预后相关）；LR-NB免疫cluster 4(高CD74、APOE、APOC1)暗示免疫细胞浸润，HR-NB同cluster 4高表达CD163、TGFB1、CSF1R、VEGFB提示免疫抑制性M2巨噬细胞，HR-NB基质cluster 5高表达CAF标记IGFBP7，另见炎症应激相关cluster 6、8。circVDJ-seq在HR-NB检出116个T细胞克隆、LR-NB仅16个；HR-NB免疫cluster 4及血管旁spot TCR克隆比例高且与TCRαβ UMI正相关，该克隆在HR标本中被排斥于主肿瘤cluster 2之外，LR-NB少见T细胞且无明确肿瘤区排斥现象，反映HR-NB具免疫排斥(exclusion)微环境伴M2巨噬细胞和应激性间质，LR-NB免疫浸润模式不同。

四、讨论与结论翻译

讨论指出：TCR谱分析对理解适应性免疫及指导疾病诊疗至关重要。circVDJ-seq通过cDNA环化及保守TCR恒定区扩增简化了克隆型获取流程，相较需大量V segment引物或昂贵长读长设备的现有方法，降低了试剂与测序成本，并规避多重PCR偏倚，也可用于TCR V基因注释不全的物种。circVDJ-seq准确还原输入cDNA中TCR序列信息（技术重复、平行长读长及同供体5'对照互证），灵敏度取决于原始cDNA质量——要求模板转换(template switching)合成全长cDNA，随机六聚体第二链合成会导致cDNA过短而丢失VDJ。虽5'导向策略敏感性最高，但circVDJ-seq能有效从存档3' scRNA-seq、 inherently 3'-directed的ATAC+RNA Multiome（含单细胞核来源）及空间转录组(Visium/Slide-seq/Stereo-seq) cDNA中回收TCR信息，甚至适用于冷冻手术保存的单细胞核snRNA-seq回溯分析。与近期LR Spatial VDJ比较显示克隆频率高度一致且灵敏度相当或略优。在神经母细胞瘤中发现T细胞与高危肿瘤区空间隔离，符合侵袭性儿童肿瘤免疫抑制微环境报道。尸检材料应用成功说明及时处理与RNA完整性检测很关键。该方法也适配Visium HD等真单细胞分辨率空间平台。

结论翻译：circVDJ-seq是一种从3'-条形码化cDNA文库中进行TCR谱分析的简洁、稳健检测方法。它广泛适用于单细胞多组学工作流程及空间转录组学，无需大量PCR引物池、捕获寡核苷酸或专用长读长测序设备，使单细胞和空间TCR库谱分析更易普及。研究人员预期circVDJ-seq将促进TCR谱分析在多样化单细胞、空间转录组平台及临床背景中的广泛应用与经济实施。