综述：CRISPR诊断技术：从跨核酸酶活性到癌症检测

《Cell & Bioscience》：CRISPR diagnostics: from trans-nuclease activity to cancer diagnosis

　　

摘要

自1992年定量聚合酶链反应（qPCR）和21世纪初等温扩增方法问世以来，基于核酸的检测技术领域经历了长达十年的停滞期。然而，2016年CRISPR-Cas系统中转核酸酶活性的发现彻底改变了核酸的分子诊断方法。典型的CRISPR诊断工作流程包括三个阶段：（1）通过CRISPR RNA（crRNA）引导的杂交实现目标识别；（2）通过工程报告分子（例如荧光团-淬灭寡核苷酸）的切割进行信号转导；（3）利用荧光、电化学或比色平台读取信号。CRISPR诊断技术在COVID-19大流行前夕出现，由于其快速性（<1小时）、对设备要求低以及适用于现场检测的特点，迅速成为qPCR的替代方案。随着SARS-CoV-2检测技术的快速发展，这一技术得到了严格验证和优化，从而促进了其在癌症诊断中的应用。最近在灵敏度（达到原子摩尔级别）和特异性（能够区分单个核苷酸）方面的进步，使得CRISPR诊断技术在癌症诊断中实现了革命性应用，包括：（1）识别核酸生物标志物，如高频体细胞突变、循环核酸和miRNA；（2）检测非核酸生物标志物，包括表观遗传异常、蛋白质、小分子和代谢物生物标志物。本文回顾了CRISPR诊断技术十年的发展历程，特别强调了其在癌症诊断中的应用进展。同时，我们也批判性地评估了目前存在的技术局限性，包括PAM序列的限制、灵敏度和特异性不足、定量分析的局限性，以及在复杂生物样本中未能满足的即时检测（POCT）需求，并探讨了应对这些挑战的潜在解决方案。

自1992年定量聚合酶链反应（qPCR）和21世纪初等温扩增方法问世以来，基于核酸的检测技术领域经历了长达十年的停滞期。然而，2016年CRISPR-Cas系统中转核酸酶活性的发现彻底改变了核酸的分子诊断方法。典型的CRISPR诊断工作流程包括三个阶段：（1）通过CRISPR RNA（crRNA）引导的杂交实现目标识别；（2）通过工程报告分子（例如荧光团-淬灭寡核苷酸）的切割进行信号转导；（3）利用荧光、电化学或比色平台读取信号。CRISPR诊断技术在COVID-19大流行前夕出现，由于其快速性（<1小时）、对设备要求低以及适用于现场检测的特点，迅速成为qPCR的替代方案。这一技术经过严格验证和优化，随着SARS-CoV-2检测技术的快速发展，促进了其在癌症诊断中的应用。最近在灵敏度（达到原子摩尔级别）和特异性（能够区分单个核苷酸）方面的进步，使得CRISPR诊断技术在癌症诊断中实现了革命性应用，包括：（1）识别核酸生物标志物，如高频体细胞突变、循环核酸和miRNA；（2）检测非核酸生物标志物，包括表观遗传异常、蛋白质、小分子和代谢物生物标志物。本文回顾了CRISPR诊断技术十年的发展历程，特别强调了其在癌症诊断中的应用进展。同时，我们也批判性地评估了目前存在的技术局限性，包括PAM序列的限制、灵敏度和特异性不足、定量分析的局限性，以及在复杂生物样本中未能满足的即时检测（POCT）需求，并探讨了应对这些挑战的潜在解决方案。