两个参与稻瘟病菌感染相关发育和致病性的MFS转运蛋白的表征

《Phytopathology Research》：Characterization of two MFS transporters involved in infection-related development and pathogenicity of the rice blast fungus

　　

主要促进因子超家族（MFS）是一个庞大的群体，在营养和代谢物转运、药物耐药性和神经信号传导中发挥重要作用。为了探索MFS转运蛋白在稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）中的潜在作用，研究人员从稻瘟病菌M. oryzae中鉴定并表征了两个MFS转运蛋白MoMfs1和MoMfs3。靶向基因破坏显示，这两个转运蛋白都参与真菌发育和杀菌剂的外排。此外，MoMFS1和MoMFS3突变体表现出细胞外过氧化物酶和漆酶活性降低，可能是由于这些酶的产生或分泌减少。有趣的是，?Momfs3突变体表现出致病性降低和入侵菌丝扩展受限，表明MoMfs3在致病性中起关键作用。代谢分析鉴定出537个下调代谢物和17种特定化合物，包括毒素、抗菌物质和生物素，表明MoMfs3参与次级代谢物的分泌。总之，研究人员的发现表明，MFS转运蛋白通过选择性调节特定的转运蛋白，对于稻瘟病菌在整个病害周期中的发育至关重要。

**论文解读：两个MFS转运蛋白在稻瘟病菌感染相关发育和致病性中的功能**

**研究背景与问题**
水稻（*Oryza sativa*）是全球半数以上人口的主粮，但稻瘟病（由子囊菌*Pyricularia oryzae*，原名*Magnaporthe oryzae*引起）每年造成全球10%–30%的粮食损失。利用抗性品种是控制该病最经济有效的方法，但由于生理小种组成复杂及菌株频率波动，主要水稻品种的抗性通常在田间栽培3–5年后减弱或失效。因此，解析*M. oryzae*生长、发育和致病性的分子机制，对于探索新杀菌剂靶点及制定综合防控策略具有重要理论价值。主要促进因子超家族（MFS）是一个古老、多样且广泛的次级主动转运蛋白群体，在营养和代谢物转运、药物耐药性及神经信号传导中起关键作用。在一些植物病原真菌中，MFS转运蛋白可分泌次级代谢物（如毒性化合物）至寄主植物，促进成功感染。然而，在稻瘟病菌中，尽管通过BLASTP分析鉴定出24个MFS转运蛋白，其功能大多未知。本研究旨在鉴定并表征稻瘟病菌中两个MFS转运蛋白MoMfs1和MoMfs3在发育、致病性及代谢物转运中的作用。

**研究人员开展的研究与结论**
研究人员通过靶向基因破坏（同源重组）构建了*MoMFS1*和*MoMFS3*的敲除突变体，并利用表型分析、qRT-PCR、酶活测定、植物感染试验、亚细胞定位及非靶向代谢组学（UPLC-qTOF-MS）等方法，系统研究了这两个转运蛋白的功能。结论表明：MoMfs1和MoMfs3均参与真菌发育和杀菌剂外排，但只有MoMfs3对致病性至关重要，其缺失导致侵入菌丝扩展受限、细胞外过氧化物酶和漆酶活性降低，并影响537种代谢物（包括毒素、抗菌物质和生物素）的下调，提示MoMfs3参与次级代谢物的分泌。该研究揭示了MFS转运蛋白在稻瘟病菌病害周期中的选择性调控作用，为稻瘟病防控提供了潜在靶点。论文发表在《Phytopathology Research》。

**主要关键技术方法**
1. 基因敲除与回补：通过重叠PCR连接靶基因侧翼序列与潮霉素抗性盒，构建基因替换载体，转化野生型Guy11原生质体，获得?*Momfs1*和?*Momfs3*突变体，并构建回补菌株（来源：*M. oryzae*菌株Guy11）。
2. 植物感染试验：将分生孢子悬浮液喷雾接种至2周龄水稻（品种CO39）和5日龄大麦幼苗，评估病斑面积；采用水稻叶鞘注射法观察侵入菌丝扩展，并按4种类型分级统计。
3. 亚细胞定位：构建MoMfs3-GFP和MoMfs1-GFP融合蛋白，在附着胞形成阶段用CMAC染料染色液泡，通过荧光显微镜观察定位。
4. 代谢组学分析：收集附着胞周围胞外液，采用UPLC-qTOF-MS进行非靶向代谢组学分析，结合HMDB和KEGG数据库进行代谢物鉴定与通路富集分析。

**研究结果**
**1. *M. oryzae*中MFS基因的鉴定**：结构域分析显示21个MFS转运蛋白含MFS_1结构域，靶向多种底物。转录组分析表明，*MGG_03102*（即*MoMFS3*）在感染阶段显著上调，另6个转运蛋白在一或两个菌株感染阶段上调，提示其可能参与致病性。

**2. *MoMFS1*和*MoMFS3*敲除突变体的生成及正常生理表型观察**：通过qRT-PCR确认*MoMFS1*和*MoMFS3*在接种后24小时上调。进化树分析显示两者在梨孢属（*Pyricularia*）和全蚀病菌（*Gaeumannomyces tritici*）中保守，均含12个跨膜螺旋。表型分析发现：?*Momfs3*突变体在CM、MM和SDC培养基上营养生长均显著减弱，?*Momfs1*突变体在CM和MM上生长受损；?*Momfs3*产孢量减少，但分生孢子形态、萌发及附着胞形成正常。

**3. MoMfs1和MoMfs3参与*M. oryzae*的杀菌剂外排**：在含四种杀菌剂的CM培养基上，?*Momfs1*突变体对嘧菌酯（AS）、丙环唑（PZ）、咪鲜胺（PC）和甲基硫菌灵（CB）的敏感性均显著增加；?*Momfs3*突变体对AS、PZ和PC敏感性增加，但对CB耐受性增强，表明两者参与AS、PZ和PC的外排。

**4. *MoMFS1*和*MoMFS3*缺失影响胞外漆酶和过氧化物酶活性**：在含刚果红（CR）的CM培养基上，突变体降解圈变小，比色法显示过氧化物酶活性显著降低；漆酶活性也降低。qRT-PCR显示，?*Momfs3*突变体中6个过氧化物酶基因和7个漆酶基因表达下调，表明缺失导致这些酶的产生或分泌减少。

**5. MoMfs3是致病性所必需的**：喷雾接种水稻和大麦，?*Momfs3*突变体病斑数量和面积均显著减少，而?*Momfs1*突变体仅在大麦离体叶片低浓度接种时病斑减轻。水稻叶鞘观察显示，?*Momfs3*突变体中侵入菌丝扩展至IV级的比例仅33.33%，远低于野生型的69.00%，表明其侵入菌丝扩展缺陷。

**6. MoMfs3的亚细胞定位**：MoMfs3-GFP在分生孢子、营养菌丝和附着胞中与CMAC染色的液泡共定位；MoMfs1-GFP定位于附着胞细胞膜。

**7. 野生型与?*Momfs3*突变体的代谢分析**：非靶向代谢组学分析附着胞周围胞外液，PCA显示两样本组间分离。共有2006个代谢物差异显著（1469个上调，537个下调），其中17种下调化合物包括毒素（如毒素T2四醇、水解伏马菌素B1）、抗菌物质和生物素。KEGG富集显示代谢途径、次级代谢物生物合成等通路显著富集。两种真菌毒素的恢复实验未能恢复?*Momfs3*的致病性。

**讨论与结论**
讨论部分指出，MFS转运蛋白在多种植物病原真菌中影响毒力，本研究中MoMfs1和MoMfs3缺失导致生长缺陷、杀菌剂外排减弱及胞外酶活性降低，但仅MoMfs3参与致病性。MoMfs3定位于液泡，暗示其可能参与蛋白质或次级代谢物的胞内囊泡运输；MoMfs1定位于细胞膜，支持其在胞内外代谢物转运中的潜力。代谢组学鉴定出17种下调化合物，但恢复实验未恢复致病性，需进一步验证。结论部分总结：两个MFS转运蛋白在*M. oryzae*发育和致病性中具有阶段特异性，MoMfs1和MoMfs3参与真菌发育和杀菌剂外排，MoMfs3在致病性和次级代谢物分泌中起关键作用。研究表明，MFS转运蛋白通过选择性调控特定成员，对稻瘟病菌在整个病害周期中的发育至关重要。