马鞭草科植物Lippia adoensis Hochst提取物及其组分对冈比亚按蚊幼虫和成虫的杀虫活性及UHPLC-MS/MS活性组分化学图谱分析

《The Journal of Basic and Applied Zoology》：Insecticidal efficacy of Lippia adoensis Hochst extract and fractions on larvae and adults Anopheles gambiae Giles and chemical profiling of active fractions by UHPLC-MS/MS

　　

摘要
背景
冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）是疟疾的主要传播媒介，传统上依赖合成杀虫剂进行防控，但这些杀虫剂存在环境风险，并对人类和动物有害。本研究旨在评估马鞭草科植物Lippia adoensis叶片甲醇提取物及其经柱色谱分离所得组分对冈比亚按蚊幼虫和成虫的杀虫效果，并利用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）分析最具活性提取物的化学图谱。
方法
研究人员通过渗漉法用甲醇提取L. adoensis叶片粉末，并对所得粗提物进行开放柱色谱分离，获得五个组分。依据世界卫生组织（WHO）指南，在125、250、500和1000 ppm浓度下，测试这些组分对冈比亚按蚊四龄幼虫的毒杀活性。成虫毒杀活性在疾病控制与预防中心（CDC）瓶中评估，浓度范围为125至1000 ppm。幼虫死亡率在24小时后记录，成虫死亡率分别在1小时和24小时后记录。研究人员通过UHPLC-MS/MS分析鉴定活性提取物的化学图谱。
结果
甲醇粗提物表现出强大的幼虫毒杀活性，半数致死浓度（LC₅₀）为18.14 ppm。组分F1在24小时后表现出最高的成虫毒杀活性，LC₅₀为223.34 ppm。UPLC-MS/MS分析鉴定出19种化合物，其中黄酮类化合物（flavonoids）是主要的生物活性化合物类别。
结论
L. adoensis叶片甲醇提取物及其组分，特别是F1，对冈比亚按蚊幼虫和成虫均表现出显著的活性。这些发现凸显了L. adoensis作为生物杀虫剂用于疟疾媒介防控的潜力，黄酮类化合物可能在其杀虫效果中发挥关键作用。

《Lippia adoensis Hochst提取物及其组分对冈比亚按蚊（Anopheles gambiae Giles）幼虫和成虫的杀虫活性及基于UHPLC-MS/MS的活性组分化学图谱分析》论文解读

**一、研究背景与问题**

疟疾是由按蚊（Anopheles spp.）传播的严重传染病，2023年全球约有2.63亿病例和59.7万死亡病例，其中非洲区域负担最重，占比超过90%。冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）是非洲地区最主要的疟疾传播媒介。传统上，针对该媒介的防控主要依赖合成杀虫剂，如拟除虫菊酯类等，用于处理蚊帐和室内滞留喷洒。然而，合成杀虫剂的长期和不当使用导致了一系列问题：媒介蚊虫对多种杀虫剂产生抗药性；杀虫剂在环境中持久残留，对人类、动物及生态系统造成危害；此外，其在当地市场供应不足，导致成本高昂，且其广谱活性常影响非靶标生物。因此，探索和开发具有杀虫活性的植物源化合物成为迫切需求，许多植物提取物已显示出替代合成杀虫剂的潜力。

马鞭草科（Verbenaceae）植物Lippia adoensis Hochst.在传统医学中用于治疗支气管炎症、结膜炎和疟疾等疾病。已有研究报告其甲醇提取物和精油对冈比亚按蚊成虫具有活性，并对其他蚊种（如伊蚊（Aedes spp.）、阿拉伯按蚊（Anopheles arabiensis））以及仓储害虫（如玉米象（Sitophilus zeamais））表现出毒性。然而，现有研究仅测试了粗提物和精油，尚未有研究系统评估其分级组分（fractions）对冈比亚按蚊的杀虫活性，也未对最具活性的组分进行详细的化学成分分析。因此，本研究旨在填补这一空白，通过对L. adoensis叶片甲醇粗提物进行柱色谱分级，评估各组分对冈比亚按蚊幼虫和成虫的毒杀活性，并利用超高分辨质谱技术解析活性组分的化学图谱，为开发基于黄酮类化合物（flavonoids）的植物源杀虫剂提供科学基础。本研究发表在《The Journal of Basic and Applied Zoology》。

**二、主要关键技术方法**

1. **植物材料与提取分馏**：植物样品于2022年8月采自喀麦隆阿达马瓦地区姆贝（Mbé），由雅温得大学国家标本馆鉴定。将3000克干燥叶片粉末用甲醇通过渗漉法提取，获得绿色膏状甲醇粗提物（methanol crude extract）。取70克粗提物与硅胶混合后，进行开放式柱色谱分离，使用正己烷/乙酸乙酯和乙酸乙酯/甲醇混合溶剂梯度洗脱，收集140个次级组分，并根据薄层色谱（TLC）结果合并为5个主要组分（F1至F5）。
2. **生物测定**：幼虫毒杀实验严格遵循世界卫生组织（WHO, 2005）标准方法。取25只冈比亚按蚊四龄幼虫，暴露于不同浓度（125、250、500、1000 ppm）的提取物或组分溶液中（含1 mL甲醇），24小时后记录死亡率，并计算半数致死浓度（LC₅₀）和95%致死浓度（LC₉₅）。成虫毒杀实验采用疾病控制与预防中心（CDC, 2010）瓶法。用不同浓度的提取物或组分溶液（125-1000 ppm/瓶）涂布250 mL玻璃瓶内壁，干燥后引入25只非血餐雌性成虫（3-5日龄），暴露1小时后转入清洁杯并提供10%糖水，24小时后记录死亡率。
3. **化学分析**：采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱联用技术（UHPLC-ESI-MS/MS）对甲醇粗提物和活性最强的组分F1进行化学图谱分析。色谱分离使用C₁₈反相色谱柱，以水和乙腈（含0.1%甲酸）为流动相梯度洗脱。质谱采用正离子模式电喷雾电离源（ESI+），扫描范围m/z 120-1200。原始数据通过MZmine 2.53和Sirius软件进行峰检测、对齐和化合物结构预测，仅保留Sirius评分高于90%的结构。统计分析采用Abbott公式校正死亡率（若对照死亡率>20%）、方差分析（ANOVA）及Tukey检验，并通过Probit分析计算LC₅₀和LC₉₅。

**三、研究结果**

**1. L. adoensis甲醇粗提物及组分对冈比亚按蚊幼虫的毒杀活性**
研究人员发现，所有测试物的幼虫死亡率均呈浓度依赖性增加。在125 ppm浓度下，各处理组死亡率从0.00%至93.00%不等；在1000 ppm浓度下，死亡率升至55.00%至100%。甲醇粗提物在125 ppm时即诱导93.00%的高死亡率，在250 ppm时达到100%。经Probit分析，甲醇粗提物的半数致死浓度（LC₅₀）最低，为18.14 ppm，LC₉₅为135.09 ppm，在所有测试物中对幼虫毒杀效果最强。组分F1和F2也表现出良好活性，其LC₅₀分别为101.83 ppm和239.86 ppm。

**2. L. adoensis甲醇粗提物及组分对冈比亚按蚊成虫的毒杀活性**
研究人员观察到，针对成虫的死亡率同样呈浓度依赖性增加。在125 ppm浓度下，处理组死亡率介于16.66%至36.66%。甲醇粗提物在125 ppm时引起26.66%死亡率，在最高浓度1000 ppm时达到100%死亡率。组分F1的毒杀活性最为显著，其24小时后的LC₅₀为223.34 ppm，LC₉₅为803.89 ppm，效果优于甲醇粗提物（LC₅₀: 342.43 ppm）及其他组分。组分F3的活性最弱，其LC₅₀为411.46 ppm。

**3. 基于UHPLC-MS/MS的活性组分定性化学图谱分析**
为进一步探究活性成分，研究人员对甲醇粗提物和最具成虫毒杀活性的组分F1进行了质谱分析。通过总离子流色谱图和Sirius软件的结构预测，共初步鉴定出22个色谱峰，并为其中19个峰提出了具体化学结构。分析表明，黄酮类化合物（flavonoids）是主要的化合物类别，鉴定出的黄酮类物质包括：hispidulin、cirsiliol、cirsimaritin、eupatorin、pectolinarigenin、5-demethylsinensetin、salvigenin等。此外，还鉴定出茉莉酸衍生物（如12-hydroxyjasmonic acid）、萜类化合物（如agathadiol diacetate、luffariellolide）以及脂肪酸酯（如methyl linoleate）。这些化合物共同构成了提取物的化学基础。

**四、讨论与结论**

在讨论部分，研究人员将本研究结果与先前研究进行了比较。甲醇粗提物对幼虫的LC₅₀（18.14 ppm）远低于Oumarou等（2018）报道的L. adoensis甲醇提取物LC₅₀（94.71 ppm），显示出更强的活性，这种差异可能归因于植物采集地、提取方法或生测条件的不同。组分F1对成虫的高活性（LC₅₀: 223.34 ppm）也与前人关于L. adoensis和同属植物对按蚊毒性的报道相符。

研究人员进一步解释了活性产生的可能机制。鉴定出的主要活性成分——黄酮类化合物（如hispidulin, salvigenin, eupatorin），已知具有神经活性，可干扰昆虫神经递质传递或作为拒食剂和生长抑制剂。此外，脂肪酸衍生物（如methyl linoleate）和萜类化合物（如luffariellolide）可能通过破坏昆虫表皮脂质双分子层、阻塞气孔或干扰离子转运来发挥作用。这些化合物可能通过协同作用，共同表现为强大的幼虫和成虫毒杀活性。研究还指出，本研究的局限性在于未使用国际参考杀虫剂（如permethrin或temephos）作为阳性对照，因此获得的LC₅₀值无法直接与WHO或CDC的敏感性阈值进行直接比较，未来需进行基准测试。

**研究结论部分翻译**：
本研究的主要目标是评估马鞭草科植物Lippia adoensis叶片甲醇粗提物及其分级组分对疟疾主要传播媒介——冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）幼虫和成虫的杀虫活性，并通过超高液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS）鉴定最有效组分和甲醇粗提物的化学图谱。在所测试的提取物中，甲醇粗提物对冈比亚按蚊幼虫活性最强，而组分1（Fraction 1）对成虫活性最强。与成虫相比，冈比亚按蚊幼虫对L. adoensis的所有组分和粗提物更为敏感。对甲醇粗提物和组分1的UPLC-MS分析鉴定出19种化合物，其中黄酮类化合物（flavonoids）是代表性最强的类别。这些发现表明，L. adoensis的甲醇粗提物及其组分1是进一步开发为生物杀虫剂的有潜力候选物。然而，在对其相对效力做出任何明确结论之前，必须解决上述局限性（如未经验证的表面沉积、重叠的置信区间以及需要更精细的剂量-反应研究）。研究人员正在进行进一步的化合物分离研究。