《Acta Parasitologica》：Molecular detection and phylogenetic characterization of Babesia and Ehrlichia in free-living opossums from southeastern Brazil
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目的：本研究调查了巴西圣保罗州野生负鼠——白耳负鼠（Didelphis albiventris）和黑耳负鼠（Didelphis aurita）——中媒介传播病原体的发生情况，重点关注巴贝斯虫属（Babesia spp.）、肝簇虫属（Hepatozoon spp
目的：本研究调查了巴西圣保罗州野生负鼠——白耳负鼠（Didelphis albiventris）和黑耳负鼠（Didelphis aurita）——中媒介传播病原体的发生情况，重点关注巴贝斯虫属（Babesia spp.）、肝簇虫属（Hepatozoon spp.）和埃立克体属（Ehrlichia spp.）。
方法：研究人员采用寄生虫学和分子生物学方法，对115份负鼠血液样本进行分析，其中包括95份D. albiventris和20份D. aurita样本。针对巴贝斯虫属（Babesia spp.）和肝簇虫属（Hepatozoon spp.）采用常规聚合酶链反应（PCR），针对埃立克体属（Ehrlichia spp.）采用巢式聚合酶链反应（nested PCR）。阳性扩增产物经测序后进行系统发育分析。
结果：来自博图卡图（Botucatu）的5份D. albiventris样本基于18 S rRNA基因检测为巴贝斯虫属（Babesia spp.）阳性，占4.35%；2份样本基于dsb基因检测为埃立克体属（Ehrlichia spp.）阳性，占1.74%。未检出肝簇虫属（Hepatozoon spp.）DNA。序列分析显示，巴贝斯虫扩增片段与Babesia sp.（GenBank：MW290046）的一致性为100%；1条埃立克体序列与Ehrlichia sp. strain Natal（GenBank：KY207546；OP270482）的一致性为100%，第2条序列与Ehrlichia sp.（GenBank：OP270482）的一致性为99.71%。系统发育重建结果显示，巴贝斯虫序列聚类于南美有袋类群（South American Marsupialia Group）内，而埃立克体序列则与既往在南美有袋类中报道的谱系聚集在一起。
结论：上述发现首次证实了巴西圣保罗州博图卡图地区野生D. albiventris中Babesia sp.和Ehrlichia sp.的分子学存在。研究结果扩展了当前对伴人栖有袋类动物中媒介传播病原体的认识，并强化了持续监测的重要性，以便在“同一健康”（One Health）视角下加深对城市—野生动物交界面宿主—病原体相互作用的理解。
该论文发表于《Acta Parasitologica》，聚焦巴西东南部伴人栖野生负鼠体内媒介传播病原体的分子流行病学特征。研究背景在于，人类活动驱动的环境改变、城市无序扩张及栖息地破坏，正在重塑节肢动物媒介及其相关病原体的地理分布和传播格局。负鼠属（Didelphis）动物具有较强生态可塑性，能够适应城市及城郊环境，并因觅食、庇护需求而频繁进入人类活动区域，增加了与家养动物和人类接触的机会。与此同时，负鼠不仅在生态系统中承担种子传播、食腐和害虫控制等功能，也被认为在多种寄生虫及媒介传播病原体的维持中发挥宿主或储存宿主作用。因此，明确巴西圣保罗州野生负鼠中巴贝斯虫属（Babesia spp.）、肝簇虫属（Hepatozoon spp.）和埃立克体属（Ehrlichia spp.）的感染情况，对于认识城市—野生动物交界面的病原循环具有重要意义。
目前相关问题主要在于：不同地区负鼠所携带的血液病原谱并不一致，病原体分布可能受局地生态条件、媒介群落组成及宿主暴露机会影响；此外，单纯寄生虫学镜检对低寄生虫血症或间歇性血症感染的检出敏感性有限，导致对野生宿主感染状态的判断存在不足。基于此，研究人员对来自圣保罗州多个市镇的野生白耳负鼠（Didelphis albiventris）和黑耳负鼠（Didelphis aurita）开展了寄生虫学联合分子检测研究，并进一步对阳性序列进行系统发育分析，以确认病原体分类地位及其与既往南美谱系的关系。研究最终证实：博图卡图地区野生D. albiventris存在Babesia sp.和Ehrlichia sp.感染，而未检出Hepatozoon spp.；其中Babesia序列归入南美有袋类群，Ehrlichia序列则与既往见于南美有袋类的谱系聚类。该研究的重要意义在于补充了巴西东南部负鼠媒介传播病原体分布证据，并为“同一健康”（One Health）框架下的城市化环境病原监测提供基础资料。
研究人员主要采用以下关键技术方法：样本来源于2021年6月至2023年5月收治于圣保罗州3家机构的115只野生负鼠，涉及7个市镇；对部分动物开展血涂片显微镜检查以观察血液寄生物和细胞内包涵体；自全血中提取基因组DNA后，对Babesia spp.和Hepatozoon spp.靶向18 S rRNA基因进行常规PCR检测，对Ehrlichia spp.靶向dsb基因进行巢式PCR检测；对阳性扩增产物实施双向测序、BLASTn同源性比对、多序列比对及最大似然法（ML）系统发育分析，并通过近似似然比检验（aLRT）评价分支支持度。
在研究结果方面，论文首先报告了样本采集情况。研究共获得115份血样，包括95只D. albiventris和20只D. aurita，个体来源覆盖博图卡图、迪亚德马、弗朗库-达罗沙、伊佩罗、奥萨斯库、圣保罗和索罗卡巴等地。样本动物涵盖雄性、雌性及性别未定个体，也包括幼体、亚成体和成体，从而为地区性病原调查提供了基础样本框架。
在“Ectoparasites”部分，研究记录了部分负鼠体表外寄生虫寄生情况。索罗卡巴来源个体检出猫蚤（Ctenocephalides felis）、长喙革蜱（Amblyomma longirostre）及人肤蝇蛆（Cochliomyia hominivorax）二龄幼虫；圣保罗和博图卡图来源个体也发现蚤、蜱及螨类寄生。由于采集具有机会性且标本量有限，研究未对这些外寄生虫实施分子检测，因此该部分主要作为宿主暴露于潜在媒介环境的生态背景信息。
在“Microscopic analysis”部分，研究人员通过血涂片镜检在1只来自索罗卡巴的成年雌性D. aurita白细胞内观察到形态上类似埃立克体（Ehrlichia-like）的包涵体，但该样本PCR检测为阴性；另一方面，PCR阳性样本在血涂片中并未观察到明确包涵体。研究据此指出，仅凭镜下形态学发现不足以确认感染状态，提示寄生虫学方法在此类病原检测中的局限性。
在“Molecular analysis”部分，研究取得了本论文最核心的证据。首先，就Babesia spp.而言，5份来自博图卡图的D. albiventris样本在18 S rRNA基因PCR检测中呈阳性，阳性率为4.35%。BLASTn分析显示，5条序列与既往在巴西D. albiventris中报道的Babesia sp.（GenBank：MW290046）一致性均为100%。进一步基于18 S rRNA基因序列构建的系统发育树显示，这些序列稳定聚类于南美有袋类群（South American Marsupialia Group）内，并与既往在D. albiventris、家栖短尾负鼠（Monodelphis domestica）及采自南浣熊（Nasua nasua）的Amblyomma sp.幼虫中检测到的Babesia相关序列形成支持度较高的分支。这一结果表明，博图卡图野生白耳负鼠所携带的巴贝斯虫属于与南美新热带区有袋类动物相关的特定谱系。
其次，就Ehrlichia spp.而言，2份来自博图卡图的D. albiventris样本经靶向dsb基因的巢式PCR检测呈阳性，阳性率为1.74%。其中1条序列与Ehrlichia sp. strain Natal（GenBank：KY207546；OP270482）一致性为100%，另1条序列与Ehrlichia sp.（GenBank：OP270482）一致性为99.71%。系统发育分析显示，这两条序列与既往在巴西和阿根廷D. albiventris中检出的Ehrlichia sp.处于同一分支，且支持度较高。该结果说明，本研究检测到的埃立克体与先前在南美有袋类中记录的谱系高度相关，提示这一基因型可能在更广阔的地理范围内存在。
再次，就Hepatozoon spp.而言，所有样本均未扩增出对应DNA。研究人员结合既往文献指出，虽然此前博图卡图负鼠中已有Hepatozoon spp.分子检出报道，但本研究未检出的结果可能与采样策略、时间差异或方法灵敏度有关。因此，不能据此简单否定该地区负鼠参与肝簇虫循环的可能性，而应理解为本次调查未获得相应分子证据。
讨论部分主要围绕检测方法差异、病原体空间异质性及系统发育意义展开。研究人员认为，血涂片镜检未能有效检出大多数阳性个体中的病原体，与巴贝斯虫病和肝簇虫病常见的低水平或间歇性寄生虫血症特征相一致，也反映出分子检测在野生动物病原筛查中的优势。同时，由于并非所有样本均具备寄生虫学观察条件，特别是博图卡图部分样本仅保存有冷冻基因组DNA，故镜检与PCR结果之间的一致性受到样本条件限制。研究还指出，Babesia和Ehrlichia仅在博图卡图的D. albiventris中检出，提示病原体分布存在局地化特征，可能与栖息地改变、宿主可获得性和媒介出现情况等生态因素有关，但鉴于阳性样本数较少，地理分布模式仍需谨慎解读。系统发育上，Babesia序列归入南美有袋类群，进一步支持Didelphis spp.与该巴贝西亚谱系之间的稳定关联；Ehrlichia序列则落入与Natal株相关的分支，支持该基因型在巴西东北部之外亦可能存在传播。尽管本研究采用dsb基因适用于Ehrlichia的分子检测和比较分析，但作者也指出，单一遗传标记会限制分类分辨率，未来可结合16 S rRNA、groEL和omp-1等位点开展更全面的遗传特征解析。
研究结论部分可译为：本研究扩展了对巴西东南部负鼠媒介传播病原体的现有认识，并首次提供了圣保罗州博图卡图市野生D. albiventris中Babesia sp.和Ehrlichia sp.的分子学证据。所鉴定的Babesia序列聚类于南美有袋类群（South American Marsupialia Group）内，支持既往关于新热带区有袋类动物相关梨形虫谱系的证据。在同一宿主物种中检出Ehrlichia sp.，结合巴西及邻近国家的既往报道，提示该基因型可能在受人类活动影响的环境中循环。这些发现进一步强调了在“同一健康”（One Health）视角下，对伴人栖野生动物及其外寄生虫持续开展监测的重要性，并有助于深化对城市—野生动物交界面宿主—病原体相互作用的理解。
