在美国发现感染绣线菊属植物的新型emaravirus和alphacytorhabdovirus

《Archives of Virology》：Discovery of a novel emaravirus and an alphacytorhabdovirus infecting Spiraea in the USA

　　

研究人员利用高通量测序技术对显示病毒感染症状的绣线菊属（Spiraea）植物进行了调查，鉴定出两种新型病毒：一种emaravirus，命名为绣线菊褪绿叶斑扭曲病毒（Spiraea chlorotic leaf spot distortion virus, SCLSDV），以及一种alphacytorhabdovirus，命名为绣线菊alphacytorhabdovirus 1（Spiraea alphacytorhabdovirus 1, SpCRV-1）。SCLSDV的完整基因组包含四个RNA片段，分别编码依赖RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase）、糖蛋白前体（glycoprotein precursor）、核衣壳蛋白（nucleocapsid protein）和运动蛋白（movement protein）。SCLSDV与梨褪绿叶斑相关病毒（pear chlorotic leaf spot-associated virus）的氨基酸一致性为33.99%–71.78%。病毒纯化和电子显微镜证实了多形性、有包膜的病毒粒子（80–100 nm），与Emaravirus属成员的形态一致。该alphacytorhabdovirus与猕猴桃病毒D（Actinidia virus D）的核苷酸一致性为70%，编码八个假定蛋白。两种新型病毒均在与绣线菊黄叶斑病毒（Spiraea yellow leaf spot virus）的混合感染中被检测到。此外，在77份表现出黄斑病（症状包括褪绿斑、叶片扭曲和坏死）的植物样本中，有50份样本的单一感染中持续检测到SCLSDV。这些发现表明，严重的黄斑症状和叶片扭曲可能与SCLSDV感染相关。此外，从症状植物上采集到瘿螨（eriophyid mites），经形态学鉴定为Calepitrimerus sp.。鉴于瘿螨在emaravirus传播中的已知作用，其存在提示它可能是SCLSDV的潜在传播媒介。

**论文解读：美国绣线菊属植物中两种新型病毒（emaravirus和alphacytorhabdovirus）的发现与鉴定**

**研究背景与问题**
绣线菊属（Spiraea，蔷薇科）植物是北温带常见的观赏灌木，已知受四种病毒侵染：李痘病毒（plum pox virus, PPV）、南芥菜花叶病毒（Arabis mosaic virus, ArMV）、绣线菊黄叶斑病毒（Spiraea yellow leaf spot virus, SYLSV，Badnavirus属）和绣线菊黄斑球状病毒（Spiraea yellow spot spherical virus, SYLSSV，未分类的Totivirus-like）。在美国，SYLSV和SYLSSV曾与绣线菊黄斑病相关。然而，近期诊断工作发现，黄斑病症状与已知病毒之间缺乏一致性。自2024年起，来自美国五个州（印第安纳、明尼苏达、纽约、俄亥俄、俄勒冈）商业苗圃的绣线菊叶片样本，虽表现出疑似病毒感染的症状，但对先前报道的绣线菊病毒检测均为阴性。部分症状植株还伴有大量瘿螨（eriophyid mite）侵染，此前曾被推测为症状原因。研究人员采用高通量测序（HTS）分析发现，这些症状植株含有先前未鉴定的病毒，而瘿螨可能作为传播媒介。本文旨在鉴定这些新型病毒，并分析其与病害的关联。该论文发表在《Archives of Virology》。

**关键技术方法**
研究人员从美国明尼苏达州（包括MN Landscape Arboretum和Ordway Japanese Garden）及印第安纳、纽约、俄亥俄、俄勒冈州的商业苗圃共采集77份绣线菊样本。主要技术包括：
1. **高通量测序（HTS）**：利用TruSeq Stranded Total RNA with Ribo-Zero Plant试剂盒制备RNA-Seq文库，在NovaSeqX平台进行150 bp双端测序，经BBDuk预处理后，使用SPAdes和Trinity组装，通过BLASTx鉴定病毒序列。
2. **cDNA末端快速扩增（RACE）**：使用5'/3' RACE试剂盒（Roche）确定SCLSDV各RNA片段的末端序列，通过TOPO? XL-2 PCR克隆和Sanger测序确认。
3. **病毒检测**：基于HTS组装的保守区域设计特异性引物，通过RT-PCR检测SCLSDV、SpCRV-1和SYLSV，以植物NAD5（NADH脱氢酶ND2亚基）作为内参。
4. **系统发育分析**：利用MAFFT进行氨基酸序列比对，MEGA X选择最佳模型，RAxML v8.2.11构建最大似然（ML）树，自展值1000次。
5. **病毒纯化与透射电镜（TEM）**：参照Tsuda等（1991）方法改良，通过蔗糖密度梯度离心纯化病毒粒子，2%磷钨酸负染后于JEOL JEM-1400Plus TEM观察。
6. **瘿螨形态鉴定**：通过乳酸消解和Hoyer's介质制片，利用Zeiss Imager.M2显微镜观察，参照诊断特征鉴定为Calepitrimerus属。

**研究结果**

**1. 通过HTS鉴定病毒**
对症状绣线菊样本的HTS分析发现两组负义RNA病毒序列：一组与Emaravirus属四个核心RNA片段同源，与梨褪绿叶斑相关病毒（PCLSaV）的氨基酸一致性为33.99%–71.68%；另一组与猕猴桃病毒D（AcVD，Alphacytorhabdovirus）的核苷酸一致性达73%，在样本SP2019（明尼苏达）和SPR-OR6（俄勒冈）中获得近全长基因组。此外，从SP2019组装出SYLSV（Badnavirus）全长序列，与已知分离株MD（MW080370）的核苷酸一致性为98.04%，表明存在混合感染。

**2. 新型emaravirus的基因组组装、组织与系统发育**
通过RACE从样本SPR621（明尼苏达西圣保罗）获得该emaravirus的完整基因组，包含四个RNA片段，每个RNA在互补链上编码一个ORF。所有片段5'和3'末端共享13 nt保守基序（5'-AGUAGUGUUCUCC-3'与3'-GGAGAACACUACU-5'），可形成互补的panhandle结构。RNA1编码RdRp，含有布尼亚病毒RdRp超家族保守结构域及内切酶结构域（参与“cap-snatching”）；RNA2编码糖蛋白前体（GP），含一个N端信号肽、三个预测跨膜结构域和7个N-糖基化位点，但缺乏切割四肽序列（ADDN）和phlebovirus糖蛋白基序；RNA3编码核衣壳蛋白（NC），含有三个推定的emaravirus核衣壳基序（FVLSFGRN_111-116、NRLA_163-166、GMEN_184-187），其中第一个基序具有显著差异，第二个基序完全保守，第三个基序中第二个氨基酸为蛋氨酸（M）；RNA4编码运动蛋白（MP），含信号肽（1-18 aa）和卷曲螺旋序列（279-304 aa），但缺乏30 kDa运动超家族结构域。平均序列深度分别为1197×、538×、7773×和2217×。ML系统发育分析显示SCLSDV与PCLSaV、CMaV2等聚为一支，且RdRp、GP、NP蛋白与已知emaravirus存在显著分歧。依据ICTV划分标准（相关基因产物氨基酸差异>25%），提议SCLSDV为新物种，基因组序列提交至NCBI（PV054127-30）。

**3. 新型alphacytorhabdovirus的基因组组装、组织与系统发育**
从样本SP2019和SPR-OR6组装出两个近全长alphacytorhabdovirus基因组。BLASTn分析显示与AcVD的核苷酸一致性约75%。基因组结构为经典植物弹状病毒组织：3'-leader-N-P-P'-P3(MP)-M-G-P6-L-5'-trailer，包含8个规范ORF和两个附加ORF。基因间区（IR）含有保守序列3'-AAUUAUUUUGAU(N)CU(G/U)-5'，包括poly-U区、间隔子和转录起始信号，与AcVD高度相似。蛋白分析显示N蛋白含核定位信号（NLS），P'与磷酸蛋白基因重叠并编码含跨膜结构域的小蛋白，P3/MP含运动蛋白样结构域和NLS，基质蛋白C端有NLS，糖蛋白含信号肽、多个N-糖基化位点和跨膜结构域，P6含跨膜区，L蛋白编码RdRp并含有单股负链病毒保守基序。与相近alphacytorhabdovirus的氨基酸一致性范围为13.2%-87.6%。依据ICTV标准（核苷酸一致性<75%且部分ORF氨基酸一致性79.5%-87.6%），结合宿主范围，提议SpCRV-1为新物种，基因组序列提交至NCBI（PV231214和PV231215）。基于L蛋白的ML树显示SpCRV-1与AcVD等形成高支持率分支（自展值100）。

**4. 病毒纯化与形态**
利用蔗糖梯度离心从样本SPR-OR6纯化病毒，观察到病毒带。TEM观察显示直径80-100 nm的多形性有包膜粒子，可见双层脂膜，符合Emaravirus属特征，未观察到杆状弹状病毒粒子。

**5. 黄斑病症状与SCLSDV、SpCRV-1感染的关联**
对77份绣线菊样本进行RT-PCR检测：SCLSDV阳性率64.94%（n=50），SpCRV-1为14.3%（n=11），SYLSV为9.1%（n=7）。明尼苏达样本中SCLSDV阳性率83.7%，俄勒冈为66.7%。SpCRV-1在俄勒冈阳性率最高（44.4%），明尼苏达为14%。SYLSV仅见于明尼苏达（16.3%）。单一感染中，SCLSDV占45.5%（35/77），SpCRV-1为2.6%（2/77），SYLSV为1.3%（1/77）。混合感染中，SCLSDV+SpCRV-1占11.7%，SCLSDV+SYLSV占7.8%，未观察到SpCRV-1与SYLSV共感染或三者共感染。主要症状包括黄化、褪绿斑、花叶、叶片扭曲和坏死，尤其是叶缘坏死，这些症状在SCLSDV单一感染的植株中频繁出现。

**6. 瘿螨鉴定**
从症状植株收集的瘿螨经形态学鉴定为Calepitrimerus属，具有背面前体节一条中背脊和两条亚背脊，中背脊终止于亚背脊之前。

**总结与讨论**
研究人员通过HTS在美国绣线菊中发现了两种新型病毒：SCLSDV（Emaravirus属）和SpCRV-1（Alphacytorhabdovirus属）。常规诊断方法（如ELISA和PCR）可能无法检测到它们，HTS显著提升了植物病毒发现能力。emaravirus的有包膜特性使其纯化困难，研究人员改良了蔗糖梯度离心法，成功纯化并观察到SCLSDV粒子，但SpCRV-1因滴度低未能可视化。SCLSDV的基因组由四个核心RNA片段组成，未发现额外片段（其近缘种PCLSaV有5个RNA）。SCLSDV分离株在遗传上存在一定多样性（核苷酸一致性77.6%-95.3%），MP最保守，RdRp最多样。SCLSDV与黄斑病症状高度相关，而SpCRV-1仅在少数样本中检出，其致病作用尚不明确，单独感染时无症状。混合感染可能影响症状严重度。流行病学上，病毒在多个州的遗传相似性表明受感染插条的人为移动是主要传播途径，需加强监测和卫生措施。研究人员开发了SCLSDV和SpCRV-1的RT-PCR检测引物。首次在绣线菊上发现Calepitrimerus属瘿螨，虽未直接证实传毒，但其存在提示可能是SCLSDV的潜在传播媒介。

**研究结论**（翻译自讨论末尾）
本研究报告了美国绣线菊中两种新型病毒（SCLSDV和SpCRV-1）的发现。SCLSDV的纯化技术为未来emaravirus的结构分析提供了见解。SCLSDV与黄斑病症状存在强关联，而SpCRV-1的作用有待进一步研究。混合感染的存在提出了病毒间相互作用的可能性。跨州的病毒遗传相似性提示受感染苗圃材料的传播，强调了加强检疫和采用无病毒繁殖材料的重要性。首次在绣线菊上发现Calepitrimerus属瘿螨，需开展传毒实验以确定其是否为病毒传播媒介，并进一步研究其生态学以阐明在病毒流行病学中的作用。