《Discover Plants》：Genetic and environmental regulation of anthocyanin biosynthesis in winged bean (Psophocarpus tetragonolobus L.)
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摘要：四棱豆（Psophocarpus tetragonolobus L.）是一种营养密集但尚未被充分利用的豆科作物，其蛋白质和油脂含量可与大豆相媲美。部分基因型在不同植物器官中表现出明显的花青素（Anthocyanin）呈色现象，有助于增强其对生物及非生物胁
摘要：四棱豆（Psophocarpus tetragonolobus L.）是一种营养密集但尚未被充分利用的豆科作物，其蛋白质和油脂含量可与大豆相媲美。部分基因型在不同植物器官中表现出明显的花青素（Anthocyanin）呈色现象，有助于增强其对生物及非生物胁迫的抗性。传统上，这类花青素可用作天然食用色素，并被认定为潜在的药物成分，对人类和动物具有多种健康益处。本研究对不同四棱豆组织中的主要花青素进行了定性与定量分析，并考察了其积累模式与发育阶段及温度的关系。此外，研究人员筛选了花青素生物合成候选基因，并通过实时荧光定量PCR（RT?qPCR，Reverse Transcription quantitative Polymerase Chain Reaction）分析了低温条件下这些基因的表达模式，以评估其在花青素生物合成中的潜在作用。超高效液相色谱（UPLC，Ultra?Performance Liquid Chromatography）分析检测到矮牵牛素?3?葡萄糖苷（Delphinidin?3?glucoside）和氰啶?3?葡萄糖苷（Cyanidin?3?glucoside）是四棱豆中的主要花青素。随着温度降低，叶片和豆荚中上述化合物的浓度升高，尤其在成熟叶和幼嫩豆荚中更为显著。通过对已做QTL（Quantitative Trait Locus，数量性状位点）定位的基因组区域进行候选基因挖掘，鉴定出两个花青素生物合成的假定调控因子：PT04_g20719，一个AP2乙烯响应转录因子（BBM2，AP2?ERF family transcription factor）；以及PT04_g20862，一个赤霉素3?β?双加氧酶4（GA3ox4，Gibberellin 3?beta?dioxygenase 4）。RT?qPCR分析证实了这些基因的差异表达，在低温时期的11月采集的组织中，高花青素积累基因型WB Purple?3中的转录本水平显著高于WB CR?2。结果表明，四棱豆中花青素的生物合成受温度和发育因素的双重影响。该发现为以提高四棱豆花青素积累量、增强其工业及保健价值的育种计划奠定了基础。
本文发表于《Discover Plants》，研究对象为四棱豆（Psophocarpus tetragonolobus L.，又称翼豆、四角豆），一种蛋白质与油脂含量可媲美大豆但尚待开发的热带豆科作物。四棱豆不同基因型在特定器官（花、叶、荚、种子）中存在明显的花青素（Anthocyanin，类黄酮Flavonoid下属的水溶性色素）呈色差异，花青素不仅赋予植物抗逆性，还具抗氧化、抗炎及预防慢性病等保健功能，可作为天然食品着色剂。目前四棱豆分子层面研究匮乏，花青素生物合成的环境调控机制及关键调控基因尚未明确，因此研究人员开展了该项研究，旨在鉴定四棱豆主要花青素组分、解析温湿与发育阶段对其积累的影响，并结合QTL（Quantitative Trait Locus，数量性状位点）定位筛选候选调控基因并进行表达验证，最终为高花青素四棱豆品种选育提供理论依据。研究证实四棱豆主要花青素为Delphinidin?3?glucoside（Dp3G）和Cyanidin?3?glucoside（Cy3G），低温促进其积累且具组织与发育特异性；从已定位QTL区间内获得两个候选基因——PT04_g20719（AP2/ERF转录因子BBM2）和PT04_g20862（GA3ox4，Gibberellin 3?beta?dioxygenase 4），二者在高花青素基因型低温下显著高表达，与花青素积累呈正相关。该成果首次在四棱豆中系统解析花青素组分及温敏积累规律并锁定候选调控基因，对四棱豆功能成分育种及开发利用有重要意义。
主要关键技术方法：选用具高花青素表型（花、叶、荚、种子呈紫色）的四棱豆基因型WB Purple?3及无花青素积累的对照基因型WB CR?2（印度贾坎德邦Latehar地区收集并经三代自交纯化），于2021—2024年种植于聚光温室并连续监测气温。采用酸化的80%甲醇（含1% HCl）提取各组织总花青素，超高效液相色谱（UPLC）以标准品对照鉴定与定量花青素组分。将已发表四棱豆花青素相关QTL侧翼标记比对至四棱豆参考基因组（BioProject: PRJNA1169650）获取QTL区间基因，经功能注释筛选候选基因。取11月（低温期）不同发育阶段叶（5、15、30 DAE＝Days After Emergence，出苗后天数）与荚（5、15、30 DAA＝Days After Anthesis，开花后天数）提取总RNA，反转录后以肌动蛋白（Actin）为内参，通过RT?qPCR（Reverse Transcription quantitative Polymerase Chain Reaction）检测候选基因相对表达量（2?ΔΔCt法）。
研究结果如下：
3.1 Identification of major classes of anthocyanins in winged bean（四棱豆中主要花青素种类的鉴定）
研究人员用UPLC比对五种花青素标准品保留时间及紫外吸收光谱，仅在WB Purple?3的花蕾、开放花、花萼、30 DAE叶及30 DAA荚中检出Delphinidin?3?glucoside和Cyanidin?3?glucoside，WB CR?2各组织均未检出花青素，与表型一致；两花青素在不同组织中相对丰度存在差异。
3.2 Differential accumulation of anthocyanins in various plant parts under declining temperature conditions（降温条件下不同部位花青素的差异积累）
研究人员于10月（28℃昼/21℃夜）、11月（22℃昼/14℃夜）、12月（18℃昼/8℃夜）取5 DAE与30 DAE叶及5 DAA与30 DAA荚测定花青素含量。结果显示：10月叶与荚花青素极低；叶中成熟叶（30 DAE）花青素随降温显著升高——11月Dp3G达27.79±1.46 μg/g DW（干重），Cy3G达642.39±8.96 μg/g DW，12月Dp3G进一步升至80.55±0.33 μg/g DW而Cy3G略降至347.18±6.14 μg/g DW，幼叶（5 DAE）花青素整体低于成熟叶但12月亦升高；豆荚中幼嫩荚（5 DAA）花青素高于成熟荚（30 DAA），11月幼荚Dp3G为18.22±0.41 μg/g DW、Cy3G为260.89±0.26 μg/g DW，12月进一步升至Dp3G 34.13±0.26 μg/g DW、Cy3G 300.45±34.76 μg/g DW，成熟荚花青素12月略降。结论：四棱豆花青素积累受低温诱导且具有组织与发育阶段特异性——成熟叶和幼嫩荚为高积累部位。
3.3 Mining candidate genes regulating anthocyanin accumulation in winged bean（四棱豆花青素积累调控候选基因挖掘）
研究人员将已报道关联花青素的QTL（qAntho1.1a、qAntho5.1、qAntho1.1b）侧翼标记比对四棱豆参考基因组，确定qAntho1.1a位于4号染色体7,303,963–7,502,244 bp（198 kb，含20个基因），qAntho5.1位于7号染色体37,324,470–37,523,869 bp（199 kb，含13个基因），qAntho1.1b位于4号染色体9,041,435–9,104,792 bp（63 kb，含6个基因），共39个基因。经功能注释与文献比对，筛选出PT04_g20719编码AP2乙烯响应转录因子BBM2（AP2/ERF transcription factor BBM2）及PT04_g20862编码赤霉素3?β?双加氧酶4（Gibberellin 3?beta?dioxygenase 4, GA3ox4）为候选调控基因。
3.4 Expression analysis of candidate genes associated with anthocyanin biosynthesis（花青素生物合成相关候选基因的表达分析）
研究人员对11月取材的各时期叶与荚进行RT?qPCR检测。PT04_g20719在WB CR?2中叶表达为1.0–2.8倍，荚为2.0–2.8倍；在WB Purple?3中叶为6.6–11.3倍（5 DAE最高），荚为6.64–13.8倍（30 DAA最高）。PT04_g20862在WB CR?2中叶为0.79–1.63倍，荚为1.19–2.04倍；在WB Purple?3中叶为2.50–4.59倍（5 DAE最高），荚为5.64–7.88倍（30 DAA最高）。结论：两候选基因在花青素高积累基因型WB Purple?3中表达显著上调，且与低温采样期及高花青素组织相对应，暗示其与花青素生物合成存在关联。
讨论部分总结：研究人员指出四棱豆主要花青素为Delphinidin?3?glucoside和Cyanidin?3?glucoside，降温促进成熟叶与幼荚中积累，其中Dp3G在持续低温下可能更易被诱导合成，而成熟叶中Cy3G后期略降可能与降解或再分配有关；幼叶对低温响应弱于成熟叶，幼荚较成熟荚更积极响应冷诱导花青素合成，反映发育与代谢状态差异。通过QTL锚定参考基因组筛得PT04_g20719（BBM2）与PT04_g20862（GA3ox4）为候选基因，RT?qPCR显示其在高花青素基因型低温下显著高表达，但本研究未检测花青素途径结构基因（CHS、CHI、F3H、DFR、ANS等）共表达及氧化损伤指标，需后续过表达/敲除等功能实验验证直接调控关系。
结论（翻译）：本研究在四棱豆中鉴定出两种花青素——Delphinidin?3?glucoside和Cyanidin?3?glucoside，其积累受低温及发育阶段显著影响，在光合活性较高的成熟叶和幼嫩荚中含量更高。通过解析已定位QTL区间，鉴定出两个可能与花青素生物合成相关的候选基因：PT04_g20719（AP2乙烯响应转录因子BBM2）和PT04_g20862（赤霉素3?β?双加氧酶4，GA3ox4）。基于RT?qPCR的表达分析显示，这两个基因的表达与花青素积累密切相关，尤其在呈紫色的WB Purple?3基因型中，其表达水平显著高于无色基因型WB CR?2。研究结果表明PT04_g20719和PT04_g20862可能与四棱豆花青素生物合成相关，但其具体功能仍有待实验验证。
