泰国巽他穿山甲（Manis javanica）的基因组（Genomic）种群结构：对保护与野生动物法医学（wildlife forensics）的启示

《Conservation Genetics》：Genomic population structure of the Sunda Pangolin (Manis javanica) in Thailand: implications for conservation and wildlife forensics

　　

穿山甲是全球非法贸易最为严重的哺乳动物，然而在现存8个物种中，多数物种的种群结构与遗传多样性仍缺乏深入了解。在泰国，巽他穿山甲（Manis javanica）面临非法猎捕压力，其在保护区之间呈破碎化分布；由于该物种隐秘的生活习性给取样与种群遗传研究带来显著困难，加之物种本身难以观测，导致对其遗传变异的了解相对有限。本研究分析了来自泰国各地具地理坐标记录的30份全基因组序列（whole genome sequences），以探讨种群结构与遗传多样性，旨在为保护管理提供信息支撑，并为野生动物法医学（wildlife forensics）工具的开发奠定基础。研究人员在泰国境内识别出4个不同的遗传种群，分别对应西部（Western）、岗亚（Khao Yai）、中南（Mid-south）和极南部（Southernmost）区域，种群间存在中度遗传分化（FST= 0.06–0.14）。西部种群显示升高的近交水平（FROH= 18.50%），而其他种群均低于12.5%（FROH< 12.5%）；极南部种群则维持最高的遗传多样性。昭披耶河（Chao Phraya River）与那空是贪玛叻山脉（Nakhon Si Thammarat Mountain range）等地理屏障与强烈的种群结构相吻合。研究发现为泰国巽他穿山甲保护建立了基础的基因组基线，明确了不同的遗传管理单元（management units）。种群特异性遗传特征为开发野生动物法医学工具提供了框架，可用于追溯泰国境内查获穿山甲的地理来源。这些认识对实施针对性保护策略、打击这一极危（Critically Endangered）物种的非法野生动物贸易具有重要意义。

论文发表于《Conservation Genetics》。研究背景方面，穿山甲是全球非法贸易最严重的哺乳动物，其中巽他穿山甲（Manis javanica）在泰国分布区破碎化严重，面临高强度非法猎捕，已被IUCN评为极危（CR）并列入CITES附录I。此前对该物种的种群遗传结构、遗传多样性及地理分化认知十分有限，尤其在泰国缺乏全基因组水平的具地理坐标（georeferenced）的参考数据，制约了保护管理单元划分与野生动物法医学（wildlife forensics）中地理溯源工具的开发。由于巽他穿山甲夜行性、洞栖、隐秘性强，传统种群遗传学需要大样本，而全基因组测序（WGS）可用较少样本刻画遗传变异，因而研究人员开展此项全基因组种群基因组学研究，以明确泰国境内巽他穿山甲的种群结构、遗传多样性格局、近交程度及地理屏障效应，为确立遗传管理单元（management units, MUs）和构建溯源单核苷酸多态性（SNP）面板提供基线数据。研究得出泰国境内存在4个遗传种群，西部种群近交显著升高，极南部种群遗传多样性最高，昭披耶河与那空是贪玛叻山脉是重要基因流屏障等结论，对保护规划与法医学应用均有重要意义。

主要关键技术方法如下：研究人员采用机会采样获取泰国境内具明确地理来源的获救及查获巽他穿山甲血液（n=25）与组织（n=6）样本共30份，另从NCBI下载中国云南、缅甸克钦及马来西亚共5份全基因组数据作为补充；所有样本进行Illumina NovaSeq平台全基因组测序（平均深度约10X）， reads经TrimGalore质控后比对至巽他穿山甲拟染色体水平参考基因组（GCA_024605085.1重构版），使用BWA-MEM完成比对，DeepVariant做变异识别，GLnexus联合调用，VCFtools与BCFtools过滤保留双等位SNP（MAF≥5%，缺失率<20%）；群体结构分析用PLINK做主成分分析（PCA）及LD修剪（窗口50 SNP，步长10，r2阈值0.2），ADMIXTURE估算K=1~7祖先组分，VCFtools计算加权Weir-Cockerham F_ST；遗传多样性用VCFtools算核苷酸多样性（π，20 Mb窗口）及个体近交系数（F_IS），ANGSD估计基因组杂合度，PLINK --homozyg识别长度≥500 kb、至少50 SNP的连续纯合片段（ROH）并计算F_ROH，FEEMS建模有效迁移面；亲缘关系用PLINK --genome与NgsRelate核查，等位基因频率谱检视判定偏差并剔除有明显判定的偏差样本（中国、缅甸组）于后续部分分析；统计检验采用混合效应ANOVA（以染色体为随机效应）、Kruskal-Wallis、Conover-Iman事后检验等。

研究结果如下：

Population structure（种群结构）：研究人员对所有35个个体（含中、缅、马样本）进行PCA与ADMIXTURE分析，PCA显示按地理来源明显聚类，前两个主成分解释率分别为15.00%与9.32%；ADMIXTURE最低交叉验证误差在K=2（分离出中缅样本与泰马样本），K=5时对应5组：中缅（CHMM）、西部、岗亚（Khao Yai, KY）、中南（MidSouth）、极南部（含泰国极南与马来西亚1份）。因中缅样本等位基因频率呈双峰分布、存在判定偏差（ascertainment bias），后续泰国马来西亚分析（n=31）剔除CHMM。FEEMS有效迁移面显示泰国中部昭披耶河流域为显著降低有效迁移区，与西部同岗亚间的遗传间断吻合。加权F_ST介于0.06~0.14，中南与西部最低（0.060），西部与极南部最高（0.141），岗亚与西部虽地理距约154 km但F_ST达0.092，反映中央泰国为屏障；F_ST尺度总体与地理距离最近样本间距大致对应。

Genetic diversity, inbreeding and ROH detection（遗传多样性、近交与ROH检测）：混合效应ANOVA显示种群间核苷酸多样性（π）无显著差异（p=0.182），极南部最高（π=0.000136），西部最低（π=0.000119）；ANGSD基因组杂合度（He）种群间差异显著（p<0.0001），极南部（He=0.00210）显著高于西部（He=0.00166）与岗亚（He=0.00179），西部显著低于中南（He=0.00194）；巽他穿山甲He与巨穿山甲（Smutsia gigantea）、黑腹穿山甲（Phataginus tetradactyla）相近，低于白腹穿山甲（Phataginus tricuspis）。ROH分析表明西部种群F_ROH中位数18.50%，其余种群均<12.5%，Kruskal-Wallis检验种群间差异显著（p=0.0488），Conover-Iman显示西部与极南部差异驱动结果；西部在各ROH长度类中值均高于极南部，个体F_ROH变异更大；F_IS均值西部最高（0.229），极南部最低（0.124），F_ROH与F_IS强正相关（Pearson r=0.815, p<0.000）；AMOVA显示种群间遗传方差分量显著（F=3.638, p=0.025）。

讨论部分总结：全基因组SNP解析的泰国巽他穿山甲种群结构较以往线粒体（mtDNA）研究分辨率更高，核基因组识别出西部、岗亚、中南、极南部4个集群，mtDNA显示的南北康加－巴塔尼线（Kangar-Pattani Line）分区与核基因组南部单集群不完全一致，暗示历史与当代进程差异；中缅样本与东南亚群明显分离，与既往东亚/东南亚分化一致。平均F_ST约0.09，与中华穿山甲邻近种群相当，反映区域生物地理因素共性。岗亚与西部虽距近但F_ST=0.092，昭披耶河及沿线城市农业带构成近期扩散障碍，FEEMS证实该区有效迁移降低；南部那空是贪玛叻山脉与康加－巴塔尼线相关屏障致中南与极南部分化（F_ST=0.069），类似格局见于其他东南亚兽类，兼具历史地理与近代生境破碎影响。遗传多样性方面，西部近交最高（F_ROH18.50%）、杂合度最低，或源于有效种群小、基因流受限、局部瓶颈，个别西部个体（A7、X3、X5）极高近交提示局部景观隔离或衰退，而最孤立西部个体X10近交偏低说明地理隔离不完全决定遗传隔离；极南部杂合度最高、F_ROH均匀且最低，历史持续较大种群或接邻马来半岛基因流所致；π无种群间差异但He与ROH揭示重要健康差异，强调需综合多位点指标评估种群活力。与既往MJA（北支）、MJB（南支）谱系比，本研究MJB类群F_ROH、He近似，本研究用全位点（含单态位点）ANGSD法减少SNP判定偏差。巽他穿山甲He与其他濒危哺乳动物（如西部大猩猩、黑猩猩）相近，虽属近期人为衰退极危种，但基因组杂合度滞后反映尚存一定基线多样性。保护意义：4个种群应视作不同管理单元（MUs），西部需考虑遗传救援（genetic rescue）降低近交，极南部优先生境保护维持高多样性；种群边界与泰国既有森林复合体（Western Forest Complex、Dong Phayayen-Khao Yai Forest Complex、Chumphon/Klong Saaeng-Khao Sok、Khao Bantad/Hala-Bala等）重合度高，可沿用现有管理框架施行遗传知情（genetically informed）保护；种群特异SNP特征可构建面板供野生动物法医学追溯泰国境内查获个体地理来源，类比其他穿山甲物种已成功开发高精度溯源SNP工具（如96个诊断SNP中位数误差72.2 km），为打击非法贸易提供科学支撑。结论部分译文：研究发现为泰国境内极危巽他穿山甲保护管理提供了新颖见解与基因组基线，填补了其生物地理学重要知识缺口；揭示的种群结构与遗传多样性可指导针对性保护策略与管理决策，支撑更有效保护措施制定；种群结构可被利用开发野生动物法医学追溯工具，助力打击该物种非法贩运；在既往信息有限背景下，结果对科学理解巽他穿山甲及未来保护实践奠定坚实基础。