巴西医院相关耐碳青霉烯多重耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)的基因组学特征：耐药基因与毒力基因的富集及blaKPC?2遗传环境在肠杆菌目中的镶嵌性

《Current Microbiology》：Genomics of Hospital-Associated Brazilian Multidrug-Resistant Klebsiella pneumoniae: Abundance of Resistance and Virulence Genes and Mosaicism of the blaKPC?2 Genetic Context Among Enterobacterales

　　

摘要：碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae, CRKP)因治疗选择有限而对全球公共卫生构成严重威胁，且携带毒力增强特征的CRKP使该状况进一步恶化。本研究旨在表征巴西东南部医院相关性感染中表现出毒力增强的CRKP菌株之毒力组(virulome)、耐药组(resistome)及blaKPC遗传环境，重点关注其分子进化与临床意义。尽管被归类为经典(classical)变异株，这些菌株显示出密集的毒力组，平均含14±0.55个毒力基因，多数与可移动遗传元件(mobile genetic elements, MGEs)关联并与重金属耐药基因共存；值得注意的是，编码大肠菌素(colicin)的cci基因首次在ST147中被报道，体现了该谱系的独特适应性。K位点(K-loci)和O位点(O-loci)呈现多样性，包括在一株ST11菌株中发现的罕见K-locus 150，该菌株存在涉及毒力相关岩藻糖合成基因gmd的重排。泛耐药组(pan-resistome)包含51个获得性耐药基因(ARGs)，平均每株14.7±2.8个，赋予对多类抗菌药物的耐药性；ARGs的共定位提示水平基因转移(horizontal gene transfer, HGT)是耐药播散的驱动因素。所有携带blaKPC?2的菌株同时含有ESBL基因，blaKPC?2通常位于Tn4401内的IncN或IncM1型质粒上，属保守遗传环境；然而，一株ST11(CC258)菌株中发现不寻常的blaKPC?2环境——与Tn5403关联，提示可能源于不同变形菌门(Proteobacteria)质粒间的假定重组事件。上述发现强调需在医院开展基因组监测以监控和理解CRKP耐药性与毒力的演化。

本研究发表于《Current Microbiology》。

【研究背景】肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae, K. pneumoniae)是重要机会性病原菌，碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(carbapenem?resistant K. pneumoniae, CRKP)因受bla_KPC等碳青霉烯酶基因介导而令治疗选择极为有限，被WHO列为关键优先级病原体。传统上K. pneumoniae分为经典(cKp)与高毒力(hvKp)，但近年发现部分CRKP虽缺典型高毒力标志却仍具较强体内毒力，且耐药与毒力基因可在同一可移动遗传元件上共传播。巴西此前缺乏对此类CRKP毒力组(virulome)、耐药组(resistome)及bla_KPC?2遗传环境多样性的系统基因组学解析，因此研究人员开展此项研究以阐明当地医院源性CRKP的分子进化特征与临床意义。

【主要关键技术方法】研究人员从巴西东南部圣埃斯皮里图州维多利亚大都会区2015年4–11月临床分离并已鉴定的40株CRKP中，选取代表不同序列型(sequence type, ST)与脉冲型的11株碳青霉烯耐药、多重耐药(multidrug?resistant, MDR)临床分离株。提取基因组DNA后行Illumina HiSeq 2500双端测序，de novo组装用SPAdes，补洞用GapFiller。荚膜(K?locus)与LPS O?locus分型用Kaptive 2.0；毒力基因与重金属耐药基因用BIGSdb?Kp及VirulenceFinder 2.0鉴定；获得性耐药基因(acquired resistance genes, ARGs)与染色体突变用ResFinder分析(98% identity阈值)；可移动遗传元件(mobile genetic elements, MGEs)用MobileElementFinder鉴定；质粒重构与分型用MOB?Suite v3.0.3中MOB?recon，含bla_KPC?2质粒用StarAMR注释；多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)七管家基因(gapA, infB, mdh, pgi, phoE, rpoB, tonB)串联比对后用MrBayes重建贝叶斯系统发育树，并在树上映射毒力与耐药决定簇分布。

【研究结果】

Nucleotide Sequence Accession Numbers and Genomic Features of CRKP Strains：11株CRKP全基因组已上传NCBI BioProject PRJNA1240238。基因组平均大小5.32±0.3 Mbp，GC含量57.5%±0.31%，编码基因约5570±42个。除19B被鉴定为Klebsiella quasipneumoniae（肺炎克雷伯菌复合体成员）外，其余均为K. pneumoniae sensu stricto。

Diversity and Genetic Features of K?Loci and O?Loci in CRKP Strains：检出7种K?locus——KL3、KL15、KL35、KL36、KL64、KL123、KL150，其中KL36最常见于ST437，KL64见于ST147，KL150仅见于ST11株2B且该株KL150的3'端gmd基因（GDP?D?甘露糖4,6?脱水酶编码基因，与岩藻糖合成及毒力相关）呈倒位并邻接插入序列IS_Kpn74，提示该K?locus存在重排。检出5种O?locus——O1/O2v1、O1/O2v2、O3b、O3/O3a、O4，O4最常见（ST437与ST340），O3b见于ST11与ST628。

Prevalence and Distribution of Virulence and Heavy Metal Resistance Genes in CRKP Strains：平均每株携带14±0.55个毒力基因。所有菌株均含I型菌毛fimH、III型菌毛mrkABCDFHIJ簇、铁载体受体iutA及铁摄取系统kfuABC。cci（大肠菌素编码基因）首报出现于ST147（51B、126B）并定位于ColRNAI质粒。clpK1（热休克AAA家族ATP酶基因）见于ST11、ST394、ST437、ST628且与MGEs（分别为IS_Kpn26、IS102）关联。重金属耐药基因——砷(ars)、铜(pco)、银(sil)抗性基因簇与毒力基因clpK1共位于同IncFII(K)质粒；汞(mer)抗性簇见于ST147等；碲(ter)抗性簇完整者见于ST340、ST384、ST628且位于IncHI1B(pNDM?MAR)质粒，部分菌株此质粒还携mer基因。表明毒力与重金属抗性的共定位可通过质粒水平转移共同扩散。

Resistome of CRKP Strains：泛耐药组含51种ARGs，平均每株14.7±2.8个。所有菌株携bla_KPC?2及至少一种ESBL基因（bla_CTX?M、bla_SHV、bla_TEM等）。氨基糖苷/氟喹诺酮类耐药基因（aac、aad、aph、armA等）、氟喹诺酮耐药基因oqxA/oqxB及质粒介导qnr（以qnrB1最常见）普遍存在。所有菌株携fosA6等 fosfomycin 谷胱甘肽转移酶基因。点突变见于ompK36/ompK37（降低膜孔蛋白通透性致β?内酰胺耐药）、acrR（调控AcrAB外排泵）、部分菌株ramR，除2B与19B外均有ramR突变。结果表明CRKP具极丰富且共定位的ARGs，利于HGT加速耐药播散。

Genetic Context of bla_KPC?2in CRKP Strains：多数菌株bla_KPC?2位于Tn4401（tnpR?tnpA?IS_Kpn7?bla_KPC?2?IS_Kpn6）内，分别搭载于IncN型质粒（ST11、ST340、ST437）或IncM1型质粒（ST147、ST384、ST394、ST628）。唯独ST11株2B呈现异常遗传环境：resolvase?IS_Kpn27?bla_KPC?2?IS_Kpn6?KlcA?Tn5403?pinR?ecoRIIR，与变形菌门不同菌种质粒序列高度相似（与K. pneumoniae质粒AZJ065、Citrobacter koseri及C. freundii质粒100%覆盖/99.95%一致性），提示源自不同Proteobacteria质粒间假定重组事件而产生新型bla_KPC?2携带复制子。

【讨论与结论总结】讨论部分指出：虽无典型高毒力标志（如气杆菌素aerobactin），但所研CRKP具密集经典毒力基因组合并与MGEs及重金属抗性共定位，提示选择压力（如重金属暴露）可能协同促进毒力与耐药扩散。K?locus多样性含罕见KL150伴gmd重排，O4与MDR克隆相关。bla_KPC?2多嵌入保守Tn4401且由IncN/IncM1质粒介导广泛播散，但ST11(CC258)株中出现与Tn5403融合的非典型环境，暗示高危克隆可通过跨菌种质粒重组获得新遗传结构，加剧传播风险。结论：本研究揭示了巴西医院CRKP中毒力—耐药基因汇聚于MGEs的复杂基因组景观，包括罕见荚膜型、重金属—毒力共转移及ST11中bla_KPC?2?Tn5403嵌合结构，强调需实施强有力的基因组监测以追踪此类高适应病原体的演化与传播。