质谱流式技术揭示重度脓毒症患者复杂的嗜中性粒细胞异质性

《Intensive Care Medicine Experimental》：Mass cytometry reveals complex neutrophil heterogeneity in patients with severe sepsis

　　

合理性：脓毒症是因感染引发危及生命的器官功能障碍的疾病，具有生物学异质性，全血转录组分析已揭示基于基因表达的分子亚型。在细胞层面，脓毒症主要由嗜中性粒细胞介导，而嗜中性粒细胞作为白细胞群体在多个领域日益被认定为具有异质性。研究人员旨在通过基于多维质谱流式技术分析重症脓毒症患者嗜中性粒细胞亚群，进一步表征嗜中性粒细胞异质性。方法：研究人员采集了17例入住重症监护病房并纳入大剂量维生素C随机对照试验的脓毒症患者全血样本，生成时间序列质谱流式(CyTOF)数据，采用无监督机器学习技术分析数据以识别不同的嗜中性粒细胞亚型，对所得亚型进行表征并描述其随时间的变化。结果：研究人员分析了约150万个门控为嗜中性的细胞事件，识别出5个簇，揭示了跨多个嗜中性粒细胞成熟与活化标志物（包括olfactomedin-4(OLFM4)、CD177、葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)、CD16和lipocalin-2）的复杂异质性。两个主导簇的主要差异在于嗜中性粒颗粒蛋白OLFM4的丰度。在第1天与第7天之间，表达OLFM4的主导簇中嗜中性粒细胞比例增加，该差异主要由安慰剂组OLFM4丰度增加驱动，而维生素C组无此变化。结论：研究结果指出了脓毒症中嗜中性粒细胞存在复杂的多维异质性，从而用源自重症脓毒症患者质谱流式的新数据扩展了当前嗜中性粒细胞异质性的概念。治疗组间簇比例时间差异的变化可能提示精准脓毒症治疗的机遇。

研究背景：脓毒症被广泛理解为感染导致的危及生命的器官功能障碍，其潜在的生物学机制存在个体间差异，这种异质性在临床表现为感染患者表现、结局和治疗反应的多样性，在分子层面全血基因表达分析已揭示基于mRNA表达模式的脓毒症分子亚型，但仅从mRNA水平推断生物学功能可能不完整。在细胞层面，宿主对感染的应答（脓毒症的关键决定因素）最初由先天免疫应答中的嗜中性粒细胞协调，已有研究报道嗜中性粒细胞在不同领域具有异质性，可通过不同流式细胞术和分子谱分析技术鉴定不同嗜中性粒细胞亚型。本研究通过质谱流式技术，采用靶向多个细胞位置和功能的抗体组合，在重症脓毒症中探究嗜中性粒细胞异质性，结合已知嗜中性粒细胞异质性知识，通过多参数定义的独特嗜中性粒细胞簇及其随时间相对丰度来扩展认知。研究人员开展了基于重症脓毒症患者临床样本的多维质谱流式研究，识别出以OLFM4和CD177表达为主要区分依据的5个广泛嗜中性粒细胞簇，发现其中存在以GLUT1、乳铁蛋白、CD16等表达为主的残留异质性， toll样受体和NFκB等信号转导分子对簇区分贡献甚微；探索性分析显示第1天至第7天存在向OLFM4高表达簇转化的趋势，该效应在安慰剂组更明显，维生素C组OLFM4表达未出现明显增加；研究说明质谱流式可作为研究脓毒症生物学的可行模态，需在更大队列中表征嗜中性粒细胞亚型以明确其与结局和治疗应答的因果联系。论文发表在《Intensive Care Medicine Experimental》。

主要关键技术方法：研究人员对来自LOVIT试验（NCT03680274，国际多中心随机对照试验评估大剂量静脉维生素C对危重脓毒症患者的影响）单中心亚组的17例需血管加压药支持的重症脓毒症患者，在Day 1（首次研究药物前）和Day 7（仍住ICU者）采集肝素抗凝血全血，加入蛋白稳定剂后置-80°C；采用质谱流式(CyTOF)抗体组合（覆盖嗜中性粒细胞鉴定、成熟与活化标志物如OLFM4、CD177、GLUT1、CD16、lipocalin-2、SVCT、CD15、MPO、CD3、CD14、CD19、CD56等），批量处理样本并在Helios仪器获取数据；用Cytobank进行归一化珠清洗和门控（CD45⁺排除红细胞血小板，排除CD3⁺T细胞、CD19⁺B细胞、CD56⁺CD16^?或CD56⁺CD16⁺NK细胞、CD14⁺MPO^?单核细胞，定为CD45⁺CD3^?CD19^?CD56^?CD16^±CD14^?MPO⁺嗜中性粒细胞）；聚类分析用R包CATALYST，排除阴性门控标志物，串联所有患者和时间点样本，t-SNE降维可视化，flowSOM聚类，依据CDF曲线肘部确定最佳簇数；时间序列分析对配对Day1/Day7样本用配对t检验，按治疗分组（维生素C vs安慰剂）比较Day1→Day7变化，用limma包线性模型加经验贝叶斯调节检验时间点间丰度差异及治疗臂×时间点的交互作用。

结果：研究人员分析了约1,475,508个门控为嗜中性的事件，非冗余得分显示数据方差主要由OLFM4、CD177、GLUT1贡献，CD16、lipocalin-2、SVCT1、乳铁蛋白贡献较小，转录因子贡献极少。通过flowSOM确定5簇模型最优：Cluster 2最小（均值3.6%），OLFM4、CD177、lipocalin-2、CD16低表达，提示为未成熟嗜中性粒细胞；Cluster 1和Cluster 3最大（分别均值49%、39%），均高表达CD177和lipocalin-2，主要差别在OLFM4（Cluster3高，Cluster1低），且在GLUT1、CD16、SVCT1上有残留异质性；Cluster4和Cluster5较小（均值5%、4%）。每患者分析显示多数样本由Cluster1和Cluster3主导，个别患者可见Cluster2、4、5为主。时间序列分析（10例有配对Day1/Day7）：Day7相比Day1，Cluster3比例中位数由35%升至59%（Cohen’s d 0.601，p=0.04），Cluster1由53%降至31%（Cohen’s d -0.461，p=0.04）；个体标志物显示SVCT1、CD16、CXCR2、CXCR1、CD15略增，TLR2略减（多重校正后不显著）。分层治疗臂：安慰剂组Cluster3由34%升至55%（p=0.03），Cluster1由46%降至31%（p=0.03）；维生素C组Day1与Day7无显著差异。个体标志物分层（未校正）：两臂SVCT1均增（安慰剂+20%，维生素C+28%），MPO均略减（安慰剂-5%，维生素C-3%）；OLFM4在安慰剂增（+37%）而维生素C无增；CXCR1在维生素C增（+41%）而安慰剂无增；pERK在安慰剂减（-17%）而维生素C无；OLFM4、CD177、TLR4、SCVT2的Day1→Day7变化方向在两臂间不一致；limma模型未发现簇或标志物有显著的治疗臂×时间点交互作用。

讨论总结：研究人员指出本研究用质谱流式鉴定了以OLFM4和CD177相对丰度为主要区分的5个嗜中性粒细胞簇，残留异质性体现在GLUT1、乳铁蛋白、CD16等，信号分子贡献小；探索性时间分析提示Day1→Day7向OLFM4^high簇（Cluster3）转化伴CD16略增，可能反映持续炎症反应，该转化主要在安慰剂组，维生素C组OLFM4未增，维生素C体外可抑制NFκB（调控OLFM4表达）可能部分解释；但严格线性模型未发现治疗交互显著性，可能源于配对分析患者数有限。既往嗜中性粒细胞异质性证据多来自传统流式、scRNA-seq、小鼠模型或健康人体外活化，本研究聚焦脓毒症内部差异而非与健康对照比，用不同标志物组合分析大量门控嗜中性事件。OLFM4（嗜中性粒颗粒蛋白，负调控杀菌活性，OLFM4⁺亚群与ARDS、脓毒症休克死亡相关）、CD177（表面标志物参与内皮迁移，脓毒症过表达，与NET形成、血小板相互作用有关）、GLUT1（主要葡萄糖转运蛋白，活化态上调支持吞噬、NET、氧化爆发能量需求）是最具异质性的标志物，本研究发现CD177与OLFM4可同向（Cluster3为CD177^highOLFM4^high，Cluster2/4为CD177^lowOLFM4^low）或反向（Cluster1为CD177^highOLFM4^low，Cluster5为CD177^lowOLFM4^high）表达，体现多维异质性；GLUT1与活化状态相关且不完全与其他活化标志物一致。现有中性粒细胞异质性研究一致发现沿炎症潜能连续谱极化（如N1/N2范式），本研究两大簇以OLFM4区分也提示沿促炎与抗炎消解轴的极化可能。复杂异质性可为精准治疗提供假设：例如TLR4动态范围窄不支持依利托兰（TLR4抑制剂）在特定亚组复用，乳铁蛋白表达跨度大可设想在精确亚组或时机用重组乳铁蛋白；类似ImmunoSep试验的免疫分型指导免疫调节治疗已是可行方向。本研究优势是用随机试验危重患者临床样本、两个时间点、质谱流式综合标志物面板；局限是CyTOF成本高致样本量小（仅单中心LOVIT亚组17例，配对分析10例），统计效能低，结果为假设生成性质，且Day7缺失非随机（早期死亡/出院），仅纳入需血管加压药的重症脓毒症，未设非感染性炎症状态及健康对照，难以判定异质性是否脓毒症特异。结论：研究人员在危重脓毒症患者血样中鉴定出嗜中性粒细胞亚群，说明存在对先天免疫炎症调节有潜在意义的复杂异质性；质谱流式是研究脓毒症生物学的可行模态；需在更大队列表征嗜中性粒细胞亚型以明确其与临床结局、脓毒症治疗应答的因果联系。