《Journal of the American Heart Association》：Alternative Preservation Strategies of Donation After Circulatory Death Hearts: Effect of Cold Ischemia Time Before Normothermic Machine Perfusion
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摘要：循环死亡后捐献（donation after circulatory death，DCD）是一项有望将供者池扩大20%至30%的策略。然而，DCD心脏移植物会经历热缺血（warm ischemia）损伤，因此在移植前进行有效的移植物活力评估至关重要。目前
摘要：循环死亡后捐献（donation after circulatory death，DCD）是一项有望将供者池扩大20%至30%的策略。然而，DCD心脏移植物会经历热缺血（warm ischemia）损伤，因此在移植前进行有效的移植物活力评估至关重要。目前评估DCD心脏的方法要么受伦理关切和地区限制影响（胸腹常温区域灌注，thoracoabdominal normothermic regional perfusion），要么需要大量资源、专业知识和设备，且在功能评估方面存在局限（直接获取并再灌注，即通过TransMedics的Organ Care System进行）。本研究探讨了一种替代保存方法，即采用控制性低温（controlled hypothermia）继以常温机械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）用于移植物评估。研究人员将DCD移植物在猪供者经历19分钟功能性热缺血（functional warm ischemia，fWIT）后获取，心脏在4?°C至8?°C下采用控制性低温静态储存（controlled hypothermic static storage）保存最长7小时，继以NMP复跳（reanimation）。移植物活力采用一种新型离体（ex?vivo）心脏负荷方法进行评估。结果与立即获取后再灌注的DCD移植物相比，经控制性低温保存最长7小时的DCD心脏移植物在功能、生化及蛋白质组学方面未观察到显著差异。控制性低温可能是现有DCD保存方法的一种可行替代方案，可消除胸腹常温区域灌注的伦理关切，并降低直接获取并再灌注带来的物流复杂性与成本。这些发现为DCD心脏保存实践潜在转变奠定了基础，提供了一种更有效且成本效益更高的途径来扩大供者池并改善移植结局。
论文发表于《Journal of the American Heart Association》。研究背景方面，心力衰竭是慢性进展性疾病，预计到2030年仅美国患病人数将超过800万，心脏移植仍是终末期心力衰竭的唯一根治手段，但供者严重短缺限制了广泛应用。循环死亡后捐献（donation after circulatory death，DCD）有望将器官供者池扩大20%至30%，但DCD心脏会经历 mandatory的热缺血时间（warm ischemia time，WIT），即撤除生命支持后至供者死亡期间冠状动脉灌注压不足导致心肌缺氧缺血，因此移植前必须进行移植物活力评估。目前临床常用的两种DCD心脏评估与保存方法均存在明显局限：一是胸腹常温区域灌注（thoracoabdominal normothermic regional perfusion），需在供者死后建立体外循环并排除脑循环以避免脑再灌注，虽可恢复腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）水平、可能激活缺血预处理并便于移植物评估，但存在伦理争议，部分地区甚至暂停使用该技术；二是直接获取并灌注（direct procurement and perfusion，DPP），即热缺血后快速获取心脏并立即在商用NMP平台（如Organ Care System，FDA批准的唯一NMP平台）上进行常温再灌注与转运评估，虽限制冷缺血、提供有氧代谢环境并允许一定ex?vivo功能评估（非工作、无负荷Langendorff模式），但需要高额设备与专业人员、物流协调复杂，且该平台缺乏稳健功能评估能力（主要指标乳酸趋势不可靠，且为非生理性无负荷模式）。DPP范式核心假设是DCD心脏必须立即常温再灌注以最小化进一步缺血损伤，但该假设缺乏充分直接证据；相反，部分研究提示再灌注前一段控制性低温可能减轻再灌注损伤、降低氧化应激并改善移植物功能。此外，控制性低温（4?°C–8?°C）在心肌梗死领域已证实可减轻再灌注损伤与炎症反应，肺移植中适度低温保存（6?°C–10?°C）也显示改善移植物功能。因此研究人员提出：采用控制性低温静态储存（controlled cold storage preservation，cCSP，4?°C–8?°C）继以在受者中心进行NMP评估，可避免便携式NMP设备的高成本与复杂物流，并允许更生理性的带负荷（loaded）ex?vivo功能评估，有可能提供更优的DCD心脏保存与评估范式。
为开展研究，研究人员主要采用以下关键技术方法：使用猪DCD模型（Yorkshire猪，30–35?kg，3–4月龄，雌雄混合），诱导呼吸暂停致供者死亡，记录平均动脉压（mean arterial pressure，MAP）<30?mm?Hg起算功能性热缺血时间（functional warm ischemia time，fWIT）共19分钟（依据UNOS数据平均WIT设定）；获取心脏后在即刻再灌注组（最小冷缺血时间，minimal CIT，n=6）与实验组（控制性低温保存cCSP于Paragonix SherpaPak系统中置University of Wisconsin溶液中，4?°C–8?°C分别保存5小时[n=7]和7小时[n=6]）间对照；所有心脏后续均在ex?vivo灌注平台（VentriFlo系统）先进行1小时逆行（Langendorf）灌注，再进行3小时左房加压带负荷（loaded）灌注（模拟近生理条件，左房压力12–14?mm?Hg重力依赖），灌注液为Krebs–Henseleit缓冲液+葡聚糖+碳酸氢钠+牛血清白蛋白+青霉素–链霉素+胰岛素+氢化可的松+肝素+氯化钙+自体分离红细胞[1:2]，37?°C，氧合100% O2，持续输注腺苷；评估手段涵盖：常规指标（灌注液进出乳酸、冠脉血管阻力、氧摄取率、心率取自左室压力记录）、非常规功能指标（左室脉压[left ventricular pulse pressure，LVPP]、心肌收缩性与舒张性[dP/dtmax、dP/dtmin]、射血分数、整体纵向应变由心外膜超声获得）、结构指标（组织水肿权重增益、H&E染色、电镜透射电镜[TEM]测线粒体形态/长宽/活性计数、拉曼共振光谱测线粒体氧化还原状态、腺苷酸能量荷[energy charge]由LC–MS/MS测ATP/ADP/AMP）、炎症因子（Luminex液相芯片测白细胞介素等，Difference-in-Differences检验）、蛋白质组学（高分辨LC–MS/MS[Orbitrap Fusion Lumos]测左右心室心肌蛋白，Proteome Discoverer搜库Sus Scrofa，Perseus进行t检验与FDR校正，DAVID做Gene Ontology[GO]分析，GSEA v4.4.0做基因集富集分析）。
结果部分保留小标题如下：
Controlled Hypothermic Preservation of DCD Grafts Before NMP Does Not Affect Graft Metabolism or Function：研究人员通过常规（可于无负荷灌注中获取，如乳酸进出、乳酸消耗=出减入、冠脉血管阻力、氧摄取率、心率）与非常规（需带负荷模式，如LVPP、dP/dtmax、dP/dtmin、射血分数、整体纵向应变）指标评估，发现所有组乳酸随时间总体上升，7小时cCSP组4小时乳酸与初始[30分钟]比无统计差异，其余组有升高；乳酸消耗、冠脉血管阻力、氧摄取率、心率在组内时间进程及组间均无显著差异；LVPP、收缩与舒张导数、射血分数、整体纵向应变在各组间及时间点上也无统计差异（射血分数约20%低于正常50%–70%，归因于非生理灌注系统，但组间无差）。表明控制性低温保存最长7小时不影响DCD心脏代谢与功能。
Moderate Hypothermic Preservation Before NMP Does Not Adversely Affect Myocardial Structure or Ultrastructure：H&E染色示右室poststorage各组心肌细胞大小正常、横纹规则、核均匀、间质无水肿；postperfusion各组右室与左室可见轻度胞质空泡化、横纹偶见中断、间质红细胞（提示血管充血），但组间无差异；4小时NMP后重量增益（水肿代理指标）minimal CIT中位33.81%（IQR10%–46.67%）、5小时cCSP45.91%（19.9%–56.8%）、7小时cCSP33.37%（19.9%–47.62%），组间无统计差异（P=0.214），结构改变直接归因于NMP而非冷保存。
Mitochondrial Ultrastructure, Oxidation-Reduction State, and Myocardial Energy Stores Are Preserved Following Moderate Hypothermic Preservation：TEM显示poststorage与postperfusion各组线粒体大小形状正常、膜完整、嵴致密规则，线粒体长度、宽度、活性比例（intact membranes and clearly defined cristae计数的活线粒体%）在poststorage与postperfusion及组间均无差异；线粒体氧化还原状态（reduced mitochondria/total mitochondria by Raman resonance spectroscopy）随时间仅在minimal CIT组3小时略高（组内较前时间点显著），组间无差异；腺苷酸能量荷poststorage与postperfusion右室各组无差异。说明控制性低温不损线粒体超微结构与能量代谢。
Controlled Hypothermic Preservation Before NMP Selectively Attenuates the Release of Selective Cytokines; NMP Induces a Robust Inflammatory Response in DCD Hearts：合并cCSP两组对照minimal CIT，在再灌注起始（30分钟，T0）各细胞因子（IL-1RA[ interleukin-1 receptor antagonist]、IL-10、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IL-18）组间无差异；灌注4小时（T4）累积值上，IL-1RA（P=0.003）与IL-12（P=0.032）在cCSP组显著低于minimal CIT，IL-1β呈趋势（P=0.073），其余因子组间无差；但两类因子（促炎与抗炎）在两组内均显著随时间上升（P<0.001），IL-18无时间效应。说明NMP引发强烈炎症反应，而前期控制性低温选择性减弱部分细胞因子累积。
Controlled Hypothermic Preservation Does Not Alter the Myocardial Proteome Before or After NMP：主成分分析（principal component analysis，PCA）显示poststorage右室cCSP与minimal CIT重叠，无显著差异蛋白（volcano plot无超出FDR<0.05且FC>0.1）；postperfusion右室与左室PCA亦未见cCSP与minimal CIT分离，仅右室postperfusion有一蛋白CYFIP-related Rac1 interactor A上调（cCSP与minimal CIT共有差异？原文：only CYFIP…upregulated after NMP in RV，且总体cCSP与minimal CIT postperfusion蛋白组无显著差异）。但NMP本身引起蛋白组变化：minimal CIT postperfusion vs poststorage右室有51个差异蛋白（FDR<0.05），cCSP组有324个差异蛋白；GO定性分析minimal CIT差异蛋白多属胞外空间、红细胞（铁离子转运、氧结合）、血小板（脱颗粒、补体活化）相关；cCSP差异蛋白除上述外还涉及炎症（ innate immune system、TLR调控）、线粒体（内膜、有氧呼吸、电子传递）、肌细胞骨架（Z盘、肌动蛋白纤维结合）。GSEA显示minimal CIT postperfusion富集核糖体、转运蛋白活性、线粒体相关集；cCSP postperfusion富集最显著的是核糖体、转录、翻译相关集（11/15 GO terms，5/15 canonical pathways），另有线粒体与炎症集但层级较低。说明控制性低温不改变基础心肌蛋白组，但NMP影响广泛（尤其在cCSP组涉及更多结构/代谢/免疫通路蛋白），GSEA提示cCSP后NMP有更强蛋白合成相关集富集。
讨论部分总结：研究人员指出本研究证明DCD心脏在4?°C–8?°C控制性低温保存最长7小时后继以NMP，其功能、代谢、结构完整性与立即NMP（minimal CIT）相当，挑战了“任何冷缺血必有害”的DPP核心假设；该策略物流更灵活（无需便携NMP设备、可常规低温转运、在受者中心再动画评估，允许带负荷生理评估），成本更低，且总体离体时间可达12小时（7小时cCSP+1小时准备+4小时NMP）而无功能损失，利于扩大地理共享、降低弃用率。控制性低温可能诱导“免疫静止（immune quiescence）”状态：蛋白组见补体系统、急性期蛋白（SERPINA1、纤维蛋白原链FGA/FGB/FGG、haptoglobin等）、部分免疫相关转录调节子（甲状腺激素受体相关蛋白3、核因子1、KH型剪接调节蛋白）在cCSP后NMP表达低于minimal CIT，对应细胞因子IL-1RA、IL-12累积减少，可能降低移植后急性排斥风险；但低温也抑制部分心肌结构/代谢蛋白（如myosin-6、MLCK、MLC12A、MAPK、catenin β-1、dynamin-1-like）表达，不过GSEA显示cCSP后NMP富集细胞骨架结构蛋白（desmin、tubulin β3、desmoplakin）与电子传递链组分的单原子阳离子跨膜转运集（SURF1、mitochondrially encoded cytochrome b、NDUFA8），提示部分关键通路可逆或适应性激活。研究人员强调温度精确控制很重要：传统0?°C–4?°C静态冷保存（static cold storage on ice）可能加剧炎症与结构损伤，而本研究4?°C–8?C控制性低温（cCSP）平衡代谢抑制与器官完整性，且蛋白合成相关GO集在cCSP后NMP更富集（11/15 vs minimal CIT 6/15），说明低温暂停后可恢复合成能力。同时NMP本身可致显著炎症激增（因子千倍升）、组织轻度损伤（空泡化、间质水肿、血管充血）与非生理负荷下功能偏低，提示未来NMP平台需优化生理条件。猪模型限制：猪心肌对缺血更敏感（高代谢率、低缺血耐受），fWIT起始系统氧饱和度若<≈70%可致不可复跳（附表S11），因此猪结果需谨慎外推人；此外仅ex?vivo评估、未做体内移植存活实验，且只左室带负荷、右室功能未评估，蛋白组混合灌注血中蛋白（但GSEA核糖体/线粒体集非血细胞来源）。最后研究人员结论翻译：本研究结果显示，中度低温下保存最长7小时的DCD心脏，保留了与立即再灌注相当的功功能、结构和代谢活力。该方法提供了比现有DPP实践更简单、更具成本效益的替代方案，并可能减轻炎症与保护线粒体完整性。这些发现支持重新评估现有DCD心脏保存方案，并为进一步优化心脏移植物流与结局的转化研究奠定基础。
