《Journal of the American Heart Association》：Identification of Centrosome Duplication‐Related Biomarkers in Hypertrophic Cardiomyopathy Through Integrative Multi‐Omics, Single‐Cell Transcriptomics, and Experimental Validation
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背景：肥厚型心肌病（Hypertrophic Cardiomyopathy, HCM）是一种以心室壁增厚和心肌纤维化为特征的常见遗传性心血管疾病。中心粒复制相关基因（Centrosome Duplication-Related Genes, CDRGs）在细胞
背景：肥厚型心肌病（Hypertrophic Cardiomyopathy, HCM）是一种以心室壁增厚和心肌纤维化为特征的常见遗传性心血管疾病。中心粒复制相关基因（Centrosome Duplication-Related Genes, CDRGs）在细胞周期调控、微管组织及细胞结构稳态中发挥关键作用，但其在HCM中的机制尚不清楚。方法：研究人员采用整合多组学策略，结合差异表达分析、加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Coexpression Network Analysis, WGCNA）、孟德尔随机化（Mendelian Randomization, MR）及多种机器学习模型鉴定与HCM相关的CDRGs；利用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）评估细胞类型特异性表达模式，并进行体外心肌细胞功能实验验证。结果：两个候选生物标志物HBEGF和VPS8在多个数据集中与HCM显著相关。单细胞转录组分析显示VPS8在心肌细胞和树突状细胞中高表达。功能实验表明，VPS8敲低抑制心肌细胞增殖、增加凋亡，并降低中心粒和微管组织相关蛋白的表达，提示其参与结构维持和细胞周期调控。结论：本研究提示CDRGs失调与HCM发病存在潜在关联，并鉴定VPS8作为连接内体-溶酶体稳态与免疫相关重构的关键调节因子，VPS8可作为HCM早期诊断和干预的候选生物标志物及潜在治疗靶点。
肥厚型心肌病中中心粒复制相关生物标志物鉴定的整合多组学、单细胞转录组学与实验验证研究解读
研究背景
肥厚型心肌病（Hypertrophic Cardiomyopathy, HCM）是最常见的遗传性心血管疾病之一，病理特征为心室壁不对称肥厚、舒张功能减退及间质纤维化，严重者可进展为心力衰竭或发生心源性猝死。目前已知约60%的家族性HCM由肌节蛋白编码基因（如MYH7、MYBPC3）突变引起，但仍有相当比例患者无明确致病突变，且现有治疗手段仅为症状缓解，缺乏针对发病机制的早期诊断标志物和靶向疗法。中心粒（Centrosome）是动物细胞的微管组织中心（Microtubule-Organizing Center, MTOC），其正常复制对细胞周期进程、纺锤体组装及胞内结构稳态至关重要。既往研究表明中心粒异常与肿瘤、神经退行性疾病及某些心肌病有关，但中心粒复制相关基因（Centrosome Duplication-Related Genes, CDRGs）在HCM中的具体作用及分子机制尚属空白。为此，研究人员通过开展整合生物信息学分析与体外功能实验，旨在系统筛选HCM中与CDRGs相关的关键生物标志物并探讨其潜在机制。
主要技术方法与数据来源
研究人员下载GEO数据库中HCM心肌组织转录组数据（训练集GSE36961，n=145；验证集GSE141910、GSE130036、GSE160997、GSE32453）及HCM单细胞数据（GSE174691）；从MSigDB获取76个CDRGs。分析流程包括：差异表达分析（limma包）、单样本基因集富集分析（ssGSEA）计算CDRG评分、WGCNA构建共表达网络筛选关键模块基因、取与差异表达基因交集得到候选基因；以eQTL为工具变量、HCM GWAS汇总数据为结局进行两样本孟德尔随机化（Two-Sample MR）推断因果方向并做异质性及多效性检验；对通过MR敏感性分析的候选特征基因用101种机器学习组合建模筛选特征基因，绘制ROC曲线评估诊断效能；用Seurat处理scRNA-seq数据注释细胞类型并分析目标基因细胞类型特异性表达；用H9c2大鼠心肌细胞系进行shRNA敲低VPS8，通过CCK-8、流式细胞术（Annexin V-FITC/PI双染）及免疫荧光/Western blot检测中心粒蛋白（γ-Tubulin、Centrin-2、CEP135、PLK4）变化。
研究结果
Identification of 800 DEGs and 759 Key Module Genes（鉴定800个差异表达基因和759个关键模块基因）
对训练集GSE36961行差异表达分析（|log2FC|>0.5, P<0.05），得到HCM组中311个上调、489个下调共800个差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）。HCM组CDRG评分显著高于对照组（P<0.001）。WGCNA以软阈值幂β=7构建无标度网络，识别出17个共表达模块，其中MEgreenyellow模块与CDRG评分正相关最强（r=0.50, P<0.001），含272个基因；MEblack模块负相关最强（r=-0.47, P<0.001），含487个基因，合计759个关键模块基因。
Identification of 34 Candidate Genes and Exploration of their Functions（鉴定34个候选基因并探索其功能）
将800个DEGs与759个关键模块基因取交集获得34个候选基因。GO富集显示这些基因显著富集于钠离子转运调控（regulation of sodium ion transport）、细胞紧密连接（tight junction）及ATP酶偶联跨膜转运活性等条目；KEGG富集于肌细胞细胞骨架（cytoskeleton in muscle cells）和吞噬体（phagosome）通路；STRING数据库构建蛋白互作网络显示SEC61A1、SOCS2、XBP1为中心节点。
Identification of 8 Candidate Feature Genes through MR Analysis（通过孟德尔随机化分析鉴定8个候选特征基因）
以34个候选基因为暴露、HCM为结局行两样本MR，IVW法初筛14个基因与HCM显著相关（P<0.05），其中HBEGF和VPS8的OR<1为保护性因素。经Cochran's Q检验排除具异质性的CDC42EP2，经MR-Egger截距检验排除具水平多效性的MYH7B、KLHL24、PAFAH2、CDC42EP2、B4GALT5，经Steiger方向性检验排除方向不确定的XBP1，最终确定WDR62、PLA2G15、HBEGF、MFN2、AZIN1、VPS8、SLMAP、RNF103共8个基因具稳健因果关联，定义为候选特征基因。
HBEGF and VPS8 Were Identified as Biomarkers with Diagnostic Potential（HBEGF和VPS8被鉴定为具诊断潜能的生物标志物）
将8个候选特征基因纳入101种机器学习组合建模，Lasso+glmBoost组合平均AUC最高（训练集AUC=0.982，验证集AUC=0.754），筛选出HBEGF、VPS8等7个特征基因（SLMAP未入选）。在训练集和验证集GSE141910中HBEGF和VPS8在HCM组均显著高表达（P<0.05），且各自ROC曲线AUC均≥0.7；在额外独立验证集GSE130036、GSE160997、GSE32453中二者表达趋势一致且AUC>0.7，故定义HBEGF和VPS8为HCM生物标志物。
ANN Model Shows Favorable Diagnostic Performance for HCM（人工神经网络模型对HCM显示出良好诊断性能）
以HBEGF和VPS8表达值为输入构建人工神经网络（Artificial Neural Network, ANN，输入层2神经元、隐层3神经元、输出层2神经元），训练集AUC=0.932，验证集AUC=0.792，混淆矩阵显示预测准确性良好，证实两基因联合诊断模型具临床应用潜力。
VPS8 Is Highly Expressed in Cardiomyocytes and Dendritic Cells（VPS8在心肌细胞和树突状细胞中高表达）
对HCM单细胞数据质控后聚类得到11个细胞群，注释为心肌细胞、树突状细胞、内皮细胞、成纤维细胞、周细胞和平滑肌细胞。UMAP及气泡图显示VPS8在心肌细胞和树突状细胞中表达最高，提示这两类细胞是VPS8介导HCM中心粒复制调控的关键细胞类型。
Validation of VPS8 Expression in H9c2 Cells（H9c2细胞中VPS8敲低验证）
Western blot确认shRNA靶向敲低VPS8蛋白表达成功，为后续功能实验奠定基础。
VPS8 Knockdown Suppresses Cell Proliferation（VPS8敲低抑制细胞增殖）
CCK-8检测显示，与对照相比sh-VPS8组H9c2细胞在转染后24 h、48 h、72 h吸光度值显著降低（P<0.05），表明VPS8缺失抑制心肌样细胞增殖能力。
VPS8 Knockdown Promotes Apoptosis（VPS8敲低促进凋亡）
Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术显示sh-VPS8组早期及晚期凋亡细胞比例较对照组显著升高（P<0.05），提示VPS8对心肌细胞具抗凋亡保护作用。
VPS8 Regulates Centrosome Proteins and Microtubule Architecture（VPS8调控中心粒蛋白和微管架构）
免疫荧光与Western blot结果一致显示，VPS8敲低后中心粒标记蛋白γ-Tubulin（γ-微管蛋白）、Centrin-2、CEP135及中心粒复制关键激酶PLK4（Polo-Like Kinase 4）的蛋白水平均下调，尤以γ-Tubulin和PLK4下降最明显，说明VPS8通过影响中心粒及微管相关蛋白的表达与组装来维持心肌细胞中心粒完整性和细胞周期进程。
讨论与结论总结
研究人员首次将中心粒复制相关基因引入HCM研究，通过整合多数据库差异分析、WGCNA、MR因果推断、机器学习诊断模型构建、scRNA-seq细胞分辨率定位及H9c2细胞功能验证，发现HBEGF和VPS8在HCM心肌组织中稳定高表达且具诊断价值。MR提示基因高水平表达是HCM的保护因素（OR<1），组织高表达可能为机体对抗病理损伤的代偿反应。HBEGF作为EGF受体（Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR）配体可通过EGFR/PI3K/Akt通路发挥心肌保护；VPS8是CORVET复合体亚基，参与早期内体成熟与内体-溶酶体系统稳态，其敲低导致γ-Tubulin和PLK4减少、心肌细胞增殖受抑并促凋亡，提示VPS8桥接内体-溶酶体稳态、中心粒复制与免疫相关重构。单细胞分析显示VPS8高表达于心肌细胞（直接调控中心粒）和树突状细胞（潜在免疫-炎症/纤维化调控），拓展了HCM免疫微环境参与的假说。研究局限性包括使用大鼠H9c2细胞株而非人原代心肌细胞、部分验证集样本量小、scRNA-seq缺正常对照等。综上，本研究表明中心粒复制相关基因失调与HCM发病机制存在关联，鉴定HBEGF和VPS8为HCM候选诊断生物标志物，其中VPS8是通过维持中心粒蛋白及微管组织参与心肌细胞结构稳态和细胞周期调控的关键调节因子，可作为HCM早期诊断和干预的潜在治疗靶点。
