直接从阳性血培养中进行快速抗菌药物敏感性试验

《Analyst》：Rapid antimicrobial susceptibility testing directly from positive blood cultures

　　

脓毒症由血流感染引起，是全球范围内的主要死亡原因，每年导致超过1000万人死亡，并对全球经济造成沉重负担。脓毒性休克是一种时间紧迫的病症，治疗每延迟一小时，死亡率约增加8%。当前脓毒症管理的一个关键限制是靶向抗菌治疗的延迟启动，这主要是由于耗时的传代培养步骤和缓慢的抗菌药物敏感性试验（AST）方法所致。本研究提出一种快速AST工作流程，可在3小时内直接从阳性血培养中完成。该方法整合了用于宿主细胞去除和细菌浓缩的智能离心装置（Smart Centrifugation Device），以及用于快速AST的阻抗流式细胞术（iFAST）。这种简化、部分自动化的方法有潜力加速脓毒症诊断，并促进及时、靶向的抗菌治疗。

### 论文解读：基于智能离心装置和阻抗流式细胞术的快速抗菌药物敏感性试验直接从阳性血培养中应用

#### 研究背景与问题
血流感染（Bloodstream Infections, BSIs）常表现为菌血症，若未及时诊治，可进展为脓毒症，这是一种由宿主对感染反应失调引起的危及生命的器官功能障碍。脓毒症是全球范围内导致死亡的主要原因之一，每年造成超过1000万人死亡，并为医疗系统带来沉重经济负担，仅美国每年因重症监护病房（ICU）入院需求就超过200亿美元。脓毒性休克是时间敏感性病症，治疗每延迟一小时，生存率约下降8%。当前脓毒症管理的关键瓶颈在于靶向抗菌治疗的延迟启动，主要原因是传统诊断流程中耗时的传代培养和慢速抗菌药物敏感性试验（AST）方法。标准流程需从阳性血培养（Positive Blood Culture, PBC）中取样本涂布至纯化平板过夜培养，随后取菌落进行AST（如纸片扩散或肉汤微量稀释），总周转时间通常为2–3天。这种延迟导致经验性广谱抗菌治疗的持续使用，进而加剧抗菌药物耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR）的上升，并恶化患者预后。因此，开发快速、表型化的AST方法直接从PBC中分析细菌生长，成为迫切需求。现有快速方法包括基因型系统（如BioFire? BCID面板，约1小时结果）和表型系统（如FASTinov、VITEK REVEAL等，4–8小时结果），但基因型方法受限于已知耐药基因检测，表型方法则需更高效的血液成分去除技术以避免对细菌活力和抗生素活性的干扰。本研究旨在整合两种已有技术——智能离心装置（Smart Centrifugation Device, SCD）和阻抗流式细胞术（impedance-based flow cytometry, iFAST），构建一个从PBC到AST结果在3小时内的全流程，以加速脓毒症诊断并实现及时靶向治疗。

#### 研究内容与结论
研究人员将SCD与iFAST平台耦合，开发了一个端到端的工作流程，直接从PBC中分离细菌并在3小时内提供可用的AST结果。以大肠杆菌（Escherichia coli，革兰阴性菌）和粪肠球菌（Enterococcus faecalis，革兰阳性菌）作为原理验证菌株，实验表明该方法能够分离活菌，并得出与金标准过夜肉汤微量稀释（broth-microdilution, BMD）一致的敏感/耐药（Susceptible/Resistant, S/R）谱。SCD通过差速离心在20分钟内从PBC中分离并浓缩细菌，同时去除大部分血细胞；随后通过短时间（<1分钟）暴露于0.2%皂苷（saponin）溶解残留的红细胞（Red Blood Cell, RBC）鬼影，以减少对iFAST检测的干扰。iFAST利用单细胞阻抗流式细胞术测量细菌在5 MHz和40 MHz两种频率下的电学特性（阻抗幅值和相位），通过抗生素暴露2小时后细菌群体在散射图上的变化（如细胞体积减小、形态改变或计数降低）判断敏感性。对于大肠杆菌，计算倍增时间约30分钟，粪肠球菌约40分钟。AST结果中，对氨苄西林（Ampicillin）耐药的大肠杆菌和敏感/耐药区分均与BMD结果和EUCAST折点一致。研究表明，短时间皂苷暴露未显著抑制细菌生长，也未歪曲AST数据。该方法将传统工作流程从2–3天缩短至3小时，具有潜在临床应用价值。论文发表在《Analyst》。

#### 主要关键技术与方法
研究人员使用了两种核心技术：一是智能离心装置（SCD），一种一次性离心管，通过程序化差速离心（100g 10分钟、200g 1分钟、3000g 10分钟）从阳性血培养（PBC）中分离和浓缩细菌，同时去除红细胞；二是阻抗流式细胞术（iFAST），通过微流控通道内的微电极阵列施加5 MHz和40 MHz的交流电压，测量单个细胞的阻抗（幅值和相位），以评估细菌对抗生素的反应。细菌分离后，样本经0.2%皂苷短暂处理（<1分钟）以溶解残留红细胞鬼影，随后稀释至肉汤培养基（MHB）中，在96孔冻干抗生素板中进行2小时抗生素暴露，最后用iFAST检测。样本来源为健康志愿者的柠檬酸化全血，加入BD BACTEC需氧血培养瓶中并接种目标菌株（ATCC标准株），阳性后约16小时获取高浓度细菌悬液。

#### 研究结果

**1. AST工作流程的开发与评估**
研究人员通过阻抗散射图和显微照片评估了SCD分离和皂苷处理的效果。初始PBC样本中可见清晰的细菌群体（直径1–1.5 μm）、校准微球（2 μm）以及完整RBC和RBC鬼影（5–7 μm）。粪肠球菌因具有溶血活性，完整RBC较少。经SCD分离后，大肠杆菌和粪肠球菌样本中均出现大量血液碎片（2–7 μm），计数显示细菌回收率有时超过100%（表1）。皂苷处理（<1分钟）后，RBC鬼影被大量破坏，碎片计数减少（大肠杆菌减少5倍，粪肠杆菌减少50%），细菌群体清晰可辨。2小时孵育后碎片进一步减少。通过计数和倍增时间测定，证实短时间皂苷暴露未显著影响细菌活力（大肠杆菌倍增时间约30分钟，粪肠球菌约40分钟）。流式细胞仪中的重合效应（coincidence）在样本稀释后得以避免。

**2. 表型AST**
研究人员对每种菌株测试了四种抗菌药物，以iFAST检测2小时暴露后的细菌计数变化，并与24小时BMD结果及EUCAST折点对比。对于大肠杆菌，氨苄西林（Ampicillin）各浓度下散射图无变化，表明耐药，与BMD中所有浓度均生长一致；对于粪肠球菌，氨苄西林同样显示耐药。而妥布霉素（Tobramycin）和庆大霉素（Gentamicin）（氨基糖苷类）导致细胞计数减少和电学尺寸变小；头孢他啶（Ceftazidime）（β-内酰胺类）引起形态变化（原生质球形成）；利奈唑胺（Linezolid）（抑菌剂）则表现为细菌计数不增加。所有iFAST得出的S/R结果均与BMD和EUCAST折点相符。研究人员指出，临床样本可能因血细胞比容、粘稠度、白细胞计数等差异而不同，但白细胞（WBC）因浓度远低于RBC且体积更大，不会干扰细菌门控。未来需用脓毒症患者血培养进行临床验证，并扩展至其他病原菌（如肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌）。

#### 讨论与结论
论文描述了一个从阳性血培养（PBC）直接进行快速表型AST的端到端工作流程。智能离心装置（SCD）与快速阻抗AST平台（iFAST）的结合，将菌血症/脓毒症的标准诊断时间从2–3天缩短至3小时。SCD通过单次程序化离心步骤产生适合iFAST或MALDI-TOF鉴定（文中提及但未展开）的细菌沉淀。短时间皂苷处理去除残留鬼影未显著抑制细菌生长，快速AST结果与经典肉汤微量稀释一致。快速AST的S/R谱与肉汤微量稀释（BMD）结果相关，展示了该工作流程在临床环境中的潜在应用。未来工作将聚焦于对菌血症患者PBC的临床验证，因为该方法需考虑真实临床血液样本的组成与变异性，并需测试更多菌种（如金黄色葡萄球菌可能聚集并粘附于RBC）。此外，需要在SCD内引入化学或机械解决方案以应对RBC鬼影的限制，并开发定制离心模块以实现与iFAST技术的完整集成。