细胞外囊泡整合型明胶海绵促进伤口愈合中的血管生成与细胞迁移

《Journal of Materials Chemistry B》：Extracellular vesicle-integrated gelatin sponges enhance angiogenesis and cell migration in wound healing

　　

伤口愈合仍是全球医疗系统面临的重大负担。基于细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）的疗法因其递送生物活性货物的能力而成为一种有前景的无细胞治疗方法。然而，其临床转化在很大程度上受限于缺乏有效的递送系统，以致无法在靶部位给药后保持EV的稳定性和生物活性。 herein，研究人员提出了一种具有临床相关性、生物相容性和可生物降解性的明胶海绵（gelatin sponge，GS），作为源自大鼠骨髓间充质基质细胞（rat bone-marrow mesenchymal stromal cell，rt-BM-MSC）的EV的功能性生物材料载体平台。GS通过戊二醛交联，随后进行冷冻干燥，以获得适合EV负载的稳定且高度多孔的结构。这种固有的多孔结构实现了EV在支架中的有效负载和整合。生物学功能实验表明，将EV整合入GS可保留并支持其生物学活性，特别是通过增强角质形成细胞迁移——这是伤口愈合过程中再上皮化的关键步骤。EV整合型GS的促血管生成潜力进一步通过离体主动脉环（ex vivo aortic ring）和离卵绒毛尿囊膜（ex ovo chorioallantoic membrane，CAM）实验进行评估，这两种实验分别模拟微血管出芽和功能性的血管网络。在这两种模型中，EV整合型GS均显著促进了新生血管形成，提供了超越传统体外实验的功能性验证。这些模型提供了血管化的生理性相关证据，而血管化是肉芽组织形成和伤口修复的基础关键过程。重要的是，GS整合增强了EV的疗效，表明生物材料微环境能够主动调节EV的生物活性并改善血管生成结果。

该论文发表于《Journal of Materials Chemistry B》，聚焦于开发一种基于细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）和明胶海绵（gelatin sponge，GS）的新型伤口修复生物材料平台。

研究背景与问题：伤口愈合，特别是慢性及复杂伤口，仍是全球医疗系统的重大负担，且随着老年人口增加，该负担预计将持续加剧。尽管细胞疗法和组织工程皮肤构建物等先进治疗策略已展现出潜力，但其临床推广仍面临干细胞分化不受控、供体来源受限以及不良免疫反应风险等局限。伤口愈合是一个涉及多种细胞类型和分子通路的高度协调的动态生物学过程，其中血管生成（angiogenesis，即从预先存在的血管形成新血管的过程）贯穿组织修复的各个阶段，对肉芽组织形成及氧气和营养供应至关重要。EV作为一种由真核和原核细胞在生理及病理条件下分泌的异质性脂质双分子层包裹颗粒，具有与其亲代干细胞相当的治疗潜力，且在安全性和临床适用性方面可能更具优势。然而，有效递送策略的缺乏限制了EV在伤口微环境中稳定存在并增强其血管生成功能的临床转化。将EV整合入载体系统可保护其免受酶促降解和系统性清除，实现损伤部位的局部富集，从而改善治疗效果。

研究人员开展的研究与主要结论：该研究将源自大鼠骨髓间充质基质细胞（rt-BM-MSC）的EV整合入明胶海绵（GS），系统评估了其在血管生成介导的伤口愈合中的应用潜力。研究首先对EV进行了分离与表征，随后评价了游离EV和GS整合型EV对角质形成细胞（HaCaT）增殖和迁移的影响，并通过离体主动脉环实验和离卵CAM实验评估了其血管生成潜能。结果表明，GS可作为保留和调节EV生物活性、增强其血管生成性能的生物材料平台。该研究为EV基伤口愈合疗法提供了一种具有转化潜力的策略，尤其适用于血管生成受损的慢性伤口。

关键技术方法：样本来源于3–8周龄雄性Wistar白化大鼠的骨髓间充质基质细胞（第4代传代细胞）。EV采用差速离心结合超速离心法分离，并通过电子显微镜、纳米颗粒追踪分析及流式细胞术进行表征。GS采用明胶经戊二醛交联后冷冻干燥制备。生物学功能评价包括：SP-DiOC(18)荧光标记法进行细胞摄取实验；MTT法检测细胞活力和抗氧化保护作用；划痕实验评估细胞迁移；荧光标记结合微孔板读数法检测EV释放动力学；离体鸡胚主动脉环实验评估微血管出芽；离卵鸡胚CAM实验评估功能性血管密度。

研究结果：

rt-BM-MSC来源EV的表征：通过qNano^?和NTA分析显示，EV平均直径分别为163 ± 66.3 nm和161.1 ± 60.9 nm，浓度分别为4.4 × 10⁹ mL^?1和4.04 × 10⁹ mL^?1。TEM观察显示EV具有典型的杯状形态，膜结构完整。流式细胞术证实了CD81表面标志物的表达，验证了所获颗粒为符合预期尺寸范围（50–200 nm）的MSC来源EV。

EV的剂量依赖性细胞摄取：浓度为10⁷至10⁹ particles mL^?1的梯度实验显示，SP-DiOC(18)标记的绿色荧光EV主要在HaCaT细胞胞质区域富集，6小时内所有测试浓度均实现成功内化，且摄取程度随EV浓度增加而显著增加，呈现清晰的剂量依赖性内化特征。

EV对细胞增殖、氧化应激和迁移反应的影响：MTT实验显示，EV对HaCaT细胞活力的影响呈剂量依赖性。低于2.5 μg mL^?1时EV未显著改变细胞活力；浓度升高后细胞活力下降，可能与EV富集的分子货物影响细胞周期动力学有关。抗氧化实验中，EV预处理展现出剂量依赖性保护效应，0.25 μg mL^?1 EV组的细胞活力最高（112.5%，p < 0.05），而10 μg mL^?1 组降至67.7%（p < 0.05）。划痕实验结果显示，所有组在24小时内均出现进行性伤口闭合，但EV处理组的剩余伤口面积（62.02%–76.99%）大于对照组（49.65%），表明游离EV在本实验条件下未能促进角质形成细胞迁移。

GS作为EV载体的可行性：冷冻干燥GS呈现白色、多孔、柔软且柔韧的结构。L-929成纤维细胞间接细胞毒性实验显示，所有GS制剂均无细胞毒性（活力均>92.5%）。SEM显示平均孔径约200 ± 50 μm。水解降解实验表明，GS-2%戊二醛组在第4天降解率为77.91%，降解速率最慢。基于降解特性和生物相容性，GS-2%戊二醛被选作EV载体。释放实验显示，EV释放随时间逐渐增加，6小时释放13.8%，72小时达86.0%，实现了可控释放。该研究首次引入鸡胚主动脉环实验评价EV整合型GS，证明了载体系统在该模型中的可行性；同时采用离卵CAM实验评估功能性血管密度，GS的应用使生物活性分子在CAM局部保留时间延长，提高了血管生成评估的可靠性。

EV整合型GS促进细胞迁移：划痕实验显示，GS对照组24小时后剩余伤口面积为30.29%，而EV整合型GS的0.25、1和10 μg mL^?1组分别为27.06%、27.28%和35.42%。与游离EV相比，EV整合入GS显著增强了伤口闭合率，0.25 μg mL^?1 EV整合型GS组的伤口面积减小最为显著，表明该平台可促进早期上皮修复。

EV整合型GS促进血管生成：离体主动脉环实验中，游离EV和EV整合型GS组在第3天和第5天均保持内皮细胞活力，EV整合型GS诱导的血管生成反应与游离EV相当。定量分析显示，5 μg mL^?1 EV整合型GS组的出芽长度（第3天：637.958 ± 138.269 μm，p < 0.05）和网络形成均高于0.5 μg mL^?1组和GS对照。离卵CAM实验中，游离EV以剂量依赖性方式增加血管密度，5 μg mL^?1组较对照组增加约30%（p < 0.05）。EV整合型GS效果更为显著，0.5 μg mL^?1和5 μg mL^?1组分别使标准化血管密度增加约25%（p < 0.05）和近50%（p < 0.001）。这表明EV整合入GS保留并增强了其促血管生成活性，GS不仅是被动载体，更是支持性递送基质，可实现局部EV保留和空间局限，促进持续的EV-细胞相互作用。

结论讨论与研究局限：该研究表明，GS可作为生物相容、可生物降解且临床可及的rt-BM-MSC来源EV局部递送平台。体外分析显示EV介导的伤口愈合相关细胞反应具有剂量依赖性，强调了EV生物活性的复杂性及进一步机制研究的必要性。划痕实验显示细胞迁移改善，主动脉环和CAM实验揭示EV整合型GS组较游离EV处理组具有增强的血管生成反应。这些发现表明GS不仅为EV提供了合适的递送基质，还可能改善其在伤口愈合相关环境中的治疗性能。总体而言，EV整合型GS代表了一种便携式、可局部应用的生物材料平台，具有转化潜力，特别适用于以血管生成受损为特征的慢性伤口。研究的下一步计划是在体内模型中验证该EV整合型GS的生物学活性。

研究结论：该研究表明GS可作为生物相容、可生物降解且临床可及的rt-BM-MSC来源EV局部递送平台。体外分析显示EV介导的伤口愈合相关细胞反应具有剂量依赖性，强调了EV生物活性的复杂性及进一步机制研究的必要性。此外，划痕实验显示细胞迁移改善，而主动脉环和CAM实验揭示EV整合型GS组较游离EV处理组具有增强的血管生成反应。这些发现表明GS不仅为EV提供了合适的递送基质，还可能改善其在伤口愈合相关环境中的治疗性能。总体而言，EV整合型GS代表了一种便携式、可局部应用的生物材料平台，具有转化潜力，特别适用于以血管生成受损为特征的慢性伤口。下一步计划是在体内模型中验证该EV整合型GS的生物学活性。