一种用于监测化疗期间粘度变化的溶酶体靶向超高灵敏度粘度探针

《Smart Molecules》：A lysosome-targeted ultra-sensitive viscosity probe for monitoring viscosity alterations during chemotherapy

　　

溶酶体粘度是癌症进展与化疗反应的关键生物标志物，但实时、精准监测仍具挑战。为解决此问题，研究人员开发了一种基于分子转子（molecular rotor）架构的新型化学传感平台，用于特异性、动态检测溶酶体粘度。该平台通过“关?开”（off?on）切换机制工作：在低粘度环境中，通过扭曲分子内电荷转移（TICT）效应使转子快速旋转，从而猝灭荧光；在高粘度条件下，受限旋转触发强发射，实现超高灵敏度与选择性响应。通过对该平台进行系统分子工程设计与筛选，研究人员确定探针PMA?H为最优候选者，其在粘度响应中表现出显著的187倍荧光增强（0.54至1410 cP），对环境具有优异的稳定性，pH、极性或生物分子的干扰极小，且具备精确的溶酶体靶向能力。随后，研究人员利用PMA?H追踪HeLa细胞中的溶酶体，揭示了凋亡、铁死亡（ferroptosis）、铜死亡（cuproptosis）和锌诱导细胞死亡过程中溶酶体粘度、形态及数量的改变。总之，该平台可实现多种化疗药物诱导的溶酶体粘度波动实时追踪，作为早期癌症诊断和溶酶体基础研究的强有力工具具有重要潜力。

研究背景：溶酶体作为细胞降解与代谢调控的主要中心，其结构、功能和行为在抗癌药物诱导的程序性细胞死亡过程中受到显著影响。溶酶体粘度是细胞微环境中的关键物理参数，直接影响分子扩散、酶反应动力学和胞内信号转导，其异常波动与动脉粥样硬化、糖尿病、炎症性疾病、阿尔茨海默病及肿瘤发生发展密切相关。化疗常引起溶酶体膜透化（LMP）及功能紊乱，导致溶酶体内未消化大分子与蛋白酶异常蓄积或易位至胞质，从而引起溶酶体粘度明显改变，该过程与细胞凋亡、炎症反应相关，并影响化疗疗效与肿瘤细胞耐药性。因此，监测溶酶体粘度变化是反映病变组织病理状态、辅助早期疾病诊断特别是评估抗肿瘤药效的重要工具。现有基于荧光寿命的粘度探针通常寿命变化范围较窄，限制检测窗口；多数基于分子内电荷转移结构的探针易受极性干扰；许多有机荧光探针的强疏水结构易导致插入蛋白空腔或聚集导致猝灭（ACQ）/聚集诱导发光（AIE），引起假阴性或假阳性；低粘度生物环境中探针背景荧光也影响检测精度。为此，研究人员开展了溶酶体靶向背景免费的化学传感平台研究，基于分子转子支架构建PMA?X探针系列，利用扭曲分子内电荷转移（TICT）机制实现低背景、高粘度激活的荧光“关?开”响应，通过系统筛选确定最优探针PMA?H，并在细胞模型中应用于多种化疗药物诱导的不同细胞死亡途径下溶酶体粘度、形态与数量变化的实时亚细胞成像分析。论文发表在《Smart Molecules》。该研究的意义在于提供了宽检测范围（0.54–1410 cP）、实时、高空间分辨率的溶酶体粘度分析工具，可定量探究不同细胞死亡路径中溶酶体功能改变，为早期癌症诊断与溶酶体基础研究提供强力分析手段。

主要关键技术方法：研究人员采用分子工程构建基于烯胺桥连接供体（两个对二甲氨基苯）与受体单元的三转子分子转子架构探针PMA?X系列（X＝H、Br、I），利用密度泛函理论（DFT）与含时密度泛函理论（TD?DFT）计算基态与激发态构象及前线分子轨道；通过甲醇/甘油混合体系标定粘度?荧光强度关系并测试pH、极性、蛋白质及多种生物小分子干扰的选择性；采用HeLa细胞（人宫颈癌细胞系）作为细胞模型，通过CCK?8法评估细胞毒性，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行亚细胞定位与商业细胞器染料（LysoTracker、ERTracker、MitoTracker）共染计算Pearson相关系数（PCC）；用不同浓度化疗与细胞死亡诱导剂（阿霉素、吉非替尼、索拉非尼、喜树碱、erastin、Cu(II)?elesclomol、吡啶硫酮锌）处理细胞后，以PMA?H染色成像分析溶酶体粘度、形态与数量变化。

2 RESULTS AND DISCUSSION

2.1 Design and characteristics of PMA?X：研究人员构建了三个基于烯胺桥连接供体与受体的分子转子探针PMA?X，两个对二甲氨基苯为电子供体，烯胺为受体，三转子增强空间限制下辐射衰减并保持扭曲、弱共轭基态构象以弱化分子内电荷转移，卤素取代调制电子分布与弛豫；合成路线明确，结构经¹H NMR、¹³C NMR、电喷雾电离高分辨质谱确认。

2.2 Photophysical properties：研究人员发现PMA?X在低极性甲苯吸收约320 nm，随溶剂极性增加红移（PMA?H在二氯甲烷447 nm、三氯甲烷450 nm、甘油475 nm肩峰约420 nm），仅在甘油中显示荧光（最大发射567 nm），PMA?H强度最高；DFT计算显示PMA?H基态呈扭曲非共面构象，前线轨道HOMO（最高占据分子轨道）与LUMO（最低未占分子轨道）空间分离，激发态完全定域不同部分，非辐射稳定构象二面角约90°、振荡强度极低（0.0007），高粘度下受限不能达90°而平面化强发光，符合TICT机制，大斯托克斯位移（92 nm）佐证构象重排；PMA?H荧光量子产率Φ＝0.169最高。在水相PBS中吸收约450 nm，pH变化不影响峰位（碱性稍降强度，生物环境少见），酸碱性下均无荧光，满足背景免费；加入人血清白蛋白（HSA）吸收略降但荧光仍无，蛋白干扰可忽略，无AIE特性；甲醇/甘油中荧光强度随粘度升约187倍（0.54–1410 cP线性R²＝0.992），PMA?Br、PMA?I最大增强114倍、86倍但亮度与粘度响应弱于PMA?H；对金属离子、活性氧（ROS）、活性氮（RNS）、氨基酸、糖等无发光响应，选择性高；光稳定性好（5 mW/cm²下相对吸收与发射降＜10%）。

2.3 Cytotoxicity and optimization of imaging conditions：研究人员以HeLa细胞评估细胞毒性，PMA?H在5 μM时细胞活力＞80%，IC₅₀约6.56 mM，PMA?Br、PMA?I明显降低活力；共聚焦显示探针快速内化，0.5–12 h荧光直方图无显著差异，12 h后细胞形态无明显变化，生物相容性好。

2.4 Fluorescence imaging and colocalization：研究人员将HeLa细胞用PMA?H与商业细胞器染料共染，PMA?H绿色斑点集中于核周，与LysoTracker蓝通道重叠度高，PCC＝0.91，强度分布一致；与ERTracker（内质网）PCC＝0.48，与MitoTracker（线粒体）PCC＝0.53，重叠差，证明PMA?H特异靶向溶酶体。

2.5 Fluorescence imaging of lysosomes during chemotherapy：研究人员用不同死亡诱导剂处理HeLa细胞后PMA?H染色。凋亡模型：阿霉素（Dox）1、2.5 μM组溶酶体粘度升（荧光均值＋17%、＋66%），5 μM组严重凋亡、LMP致溶酶体数减少荧光下降；吉非替尼（Gef）10、20、30 μM组荧光升224%、248%、270%，溶酶体蓄积粘度剧增；索拉非尼（Sor）5、10 μM无显著粘度变化，20 μM凋亡伴LMP使探针弥散胞质核仁、平均强度降；喜树碱（CPT）5、10 μM无浓度?荧光关联，20 μM细胞死亡但无溶酶体斑点，胞质粘度剧增（＋154%），严重LMP。铁死亡（ferroptosis）模型：erastin 5、10 μM组荧光升55%、73%，20 μM组球形细胞囊泡结构消失、LMP致平均强度降。铜死亡（cuproptosis）模型：Cu(II)?elesclomol 0.01、0.05 μM组荧光升63%、123%，0.1 μM组探针弥散至胞质核仁、溶酶体泄漏、平均强度降。锌诱导细胞死亡模型：吡啶硫酮锌（ZnPT）0.5、1 μM组荧光升50%、83%，形态变化不明显但溶酶体黏度增加。化疗后再共染LysoTracker显示PCC＞0.9，证实增强荧光主要来自溶酶体而非非特异性蓄积。

3 CONCLUSION：研究人员总结指出，基于多可旋转芳香单元TICT调控发射构建的PMA?X探针系列在低粘度下荧光猝灭、高粘度下显著增强；PMA?H最优，线性范围0.54–1410 cP、187倍增强、高稳定、特异靶向溶酶体，可实现抗癌药诱导凋亡、铁死亡、铜死亡、锌诱导细胞死亡中溶酶体粘度实时可视；吉非替尼凋亡模型溶酶体粘度较对照升约270%，铁死亡与铜死亡中度升高，锌诱导死亡粘度变化不显著，表明粘度改变与溶酶体功能紊乱及凋亡进展密切相关。该粘度响应传感平台为多样细胞死亡路径中溶酶体粘度定量探测提供了强有力分析工具。