《VIEW》：Nanobodies as next-generation targeting platforms: From discovery technologies to translational biomedicine
纳米抗体（Nanobodies, Nbs）源自骆驼科动物重链抗体（Heavy-Chain-Only Antibodies, HCAbs）的可变区，凭借其纳米级尺寸、卓越的稳定性以及识别传统抗体无法触及的隐蔽表位（Cryptic Epopes）的独特能力，已成为现代生物医学领域的变革性工具。本综述全面概述了纳米抗体领域的最新进展，涵盖从基础发现到高级转化及临床应用。首先阐述了区分纳米抗体与经典免疫球蛋白的结构及生化特征，这些特征奠定了其优良的生物物理特性基础。随后系统总结了当前纳米抗体的发现与生产策略，包括免疫库、天然库及合成/半合成文库的构建，先进的展示与筛选技术，以及多样化的表达平台。重点聚焦于纳米抗体在诊断与治疗中的应用：在诊断方面，强调了其在体外生物传感及体内分子成像中日益增长的作用；在治疗方面，批判性讨论了其在肿瘤免疫治疗、传染病干预以及针对神经系统疾病的新型应用中的最新进展。最后，回顾了基于纳米抗体的药物临床转化现状及已获批药物，并探讨了剩余挑战与未来展望。综上所述，本综述旨在为理解纳米抗体从多元化发现平台演变为下一代生物医学解决方案提供严谨且综合的参考资源。
1 引言
抗体是适应性免疫系统的核心效应分子，长期以来一直是基础研究、疾病诊断和临床治疗不可或缺的工具。常规免疫球蛋白G（IgG）呈典型的Y型结构，由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，总分子量约为150 kDa。每个重链包含一个可变区（VH）和三个恒定区（CH1-CH3），而每个轻链由一个可变区（VL）和一个恒定区（CL）组成。抗原识别由配对的VH和VL结构域介导，其互补决定区（Complementary-Determining Regions, CDRs）共同形成抗原结合位点。1993年，Hamers-Casterman及其同事报道了在骆驼科动物中发现的一类非常规抗体，即重链抗体（HCAbs），这类抗体天然缺乏轻链和CH1结构域。这些抗体仅由两个恒定区（CH2和CH3）和一个完全负责抗原识别的单可变区（即VHH）组成。这一发现从根本上挑战了重链和轻链对于功能性抗体结合都是必需的长期范式，并为单域抗体形式的开发奠定了概念基础。随后，在软骨鱼中鉴定出了一类独特的重链抗体，即免疫球蛋白新抗原受体（Immunoglobulin New Antigen Receptors, IgNARs）。IgNARs拥有一个具有独特结构特征的可变区（V-NAR），进一步扩展了自然发生的抗体结构的多样性，并启发了新的抗体工程途径。
骆驼科VHH结构域的分子量仅为12-15 kDa，是能够高亲和力、高特异性识别靶标的最小自然发生抗原结合单元。由于其纳米级尺寸和独特的性质，VHH结构域通常被称为“纳米抗体”。与传统抗体和抗体片段相比，纳米抗体结合了多种理想特性，包括简单的单体结构、强结合亲和力、卓越的热和化学稳定性、高溶解度以及易于基因操作。这些属性推动了纳米抗体作为多功能分子工具的快速增长。在过去的二十年中，纳米抗体已被广泛应用于从结构生物学、活细胞成像到体外诊断、分子成像、靶向药物递送和肿瘤免疫治疗的广泛领域。它们进入凹陷或构象表位的能力，加上良好的药代动力学和可制造性特征，加速了它们从实验室研究向临床开发的转化。值得注意的是，首个基于纳米抗体的治疗药物caplacizumab的获批，进一步验证了这种抗体形式的临床可行性，并刺激了对下一代纳米抗体衍生生物制剂的深入研究。
2 结构与特征
纳米抗体仅由骆驼科HCAbs的可变区（VHH）组成，缺乏轻链和恒定区。结构上，VHH结构域由四个框架区（Framework Regions, FR1-FR4）和三个CDRs（CDR1-CDR3）组成。这七个片段折叠成一个紧凑的β-夹心结构，由两个反向平行的β-折叠组成，三个CDRs聚集在分子的一端形成抗原结合互补位。几乎所有的VHH都含有一个连接FR1和FR3的保守二硫键，该键横跨蛋白质内部并连接两个β-链，增强了结构稳定性。与传统抗体利用配对VH和VL结构域提供的六个CDRs不同，纳米抗体仅包含三个CDRs。其中，CDR3在序列和结构上更长且更多样，在抗原结合中起主导作用。纳米抗体的CDR3通常比传统人VH结构域的CDR3长3-4个残基。这种延长的环允许纳米抗体形成独特的凸面形状互补位，能够穿透传统IgG平坦互补位在空间上无法进入的凹陷或隐蔽表位，如酶活性位点或病毒裂隙。为了抵消与如此长环相关的高构象熵以及潜在的结合亲和力损失，纳米抗体经常采用非经典二硫键。这些辅助键通常将CDR3连接到CDR1或FR2中的半胱氨酸残基，使环结构刚性化，通过降低结合的熵成本来预先组织高亲和力相互作用。此外，CDR3与特定FR2残基之间的分子内堆积相互作用已被证实可以稳定CDR3的构象，防止纳米抗体在常规抗体通常会变性的极端条件下失去亲和力和热稳定性。
纳米抗体表现出一系列独特的理化性质。最显著的特征是其极小的尺寸（12-15 kDa），约为全长IgG抗体的十分之一。这种紧凑的结构赋予了其优异的组织渗透能力，并能通过各种生物屏障，包括血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）。另一个区别于传统抗体的标志性生化特征是优异的水溶性，这主要归因于FR2中特征性的氨基酸取代。在传统IgG抗体中，四个高度保守的疏水残基（Val37, Gly44, Leu45, Trp47）介导VH和VL结构域的二聚化。在纳米抗体中，这些残基被更具亲水性或带电荷的氨基酸取代，特别是Phe37（或Tyr37）、Glu44、Arg45和Gly47。这种取代有效地将一个大的易聚集疏水斑块转变为亲水表面，这是VHH结构域在没有轻链的情况下仍具有优异溶解性的基础。此外，CDR3环通常在其N端和C端边界下方形成一个小的疏水簇，这有助于稳定结构并防止二聚化，部分覆盖了以前的VH-VL界面。
纳米抗体还以其卓越的稳定性而闻名。这种优越的稳定性不仅仅是其小尺寸避免了轻重链配对的副产品，而是复杂结构进化的结果，包括亲水性框架突变、额外稳定二硫键的开发以及增强溶解度和抗聚集能力的高净表面电荷。这些机制共同使纳米抗体能够在通常会使传统抗体失活的环境中保持结构完整性。例如，许多纳米抗体在高温、宽pH范围和蛋白水解环境下仍能保持结构完整性和结合活性。值得注意的是，它们通常表现出显著的复性能力，允许在热或化学变性后恢复生物活性。这些特性使纳米抗体有别于大多数传统抗体片段，使其在需要在苛刻条件下稳健性能的应用中特别具有吸引力。
从功能角度来看，纳米抗体实现的结合亲和力在纳摩尔到皮摩尔范围内，可与或超过传统单克隆抗体（Monoclonal Antibodies, mAbs）。VHH的CDR1和CDR3通常比人VH结构域长，潜在地增加了互补构象的多样性，从而实现了与相应抗原的高度形状表面互补性。这在某种程度上弥补了因缺乏轻链以及小尺寸可能导致的序列多样性减少而引起的抗原结合能力下降。它们的凸面互补位主要由延长的CDR3环形成，优先识别较大的抗体无法接近的凹陷或隐蔽表位。此外，由于纳米抗体与人VH结构域的高度序列同源性以及缺乏恒定区，它们通常表现出较低的固有免疫原性。如果需要，可以通过既定的人源化策略进一步最小化免疫原性。
纳米抗体的小分子量也影响了其体内的药代动力学。虽然它促进了快速深入致密生物组织，使其能够到达实体瘤内的表位或穿过BBB，但也导致其分子量远低于40-50 kDa的肾滤过阈值。因此，单体纳米抗体的全身半衰期非常短（通常小于1小时），这对于减少分子成像中的背景噪声是有利的，但通常不足以产生治疗效果。为了解决这一限制，已经开发了多种半衰期延长策略，包括与Fc结构域融合、白蛋白结合纳米抗体或聚乙二醇化，从而能够根据特定的临床应用灵活调整药代动力学特征。半衰期延长策略的临床整合在envafolimab和ozoralizumab的对比药理学特征中得到了最佳例证。Envafolimab是一种抗程序性死亡配体1（Programmed Death Ligand 1, PD-L1）纳米抗体，与人的IgG1 Fc片段融合，实现了长达23天的显著延长的平均有效半衰期。药代动力学分析表明，每周一次皮下注射0.75 mL即可递送150 mg融合蛋白，由于其高溶解度（200 mg/mL），可为癌症患者提供足够的暴露量。虽然Fc融合延长了循环驻留时间，但由此产生的二价构建体（约80 kDa）采用了更大的流体动力学半径，使其更接近传统IgG的分布特征。相反，ozoralizumab——一种靶向肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-alpha, TNF-α）的三价化合物——采用抗人血清白蛋白（Human Serum Albumin, HSA）VHH结构域实现约18.2天的半衰期，同时保持仅38 kDa的紧凑分子量。与传统的mAbs和较大的Fc融合蛋白相比，这种显著减小的分子尺寸有助于快速深入地渗透到类风湿性关节炎关节滑膜等隔离的病理区域，在临床益处上表现为皮下给药后早在2天即可观察到疗效。因此，这些格式之间的选择通常取决于目标病理学：Fc融合最大限度地提高了曲线下面积和给药便利性，适用于全身性靶点；而HSA结合格式则为需要微小域抗体固有的快速组织渗透动力学与长期持久性之间微妙平衡的应用提供了卓越的解决方案。
3 发现与生产
纳米抗体试剂和治疗药物的成功开发关键取决于稳健、可扩展的发现、筛选和生产策略。在过去的二十年中，纳米抗体技术已经成熟为一个集成的流程，涵盖了理性文库设计、高严格度筛选和成本效益高的生产。重要的是，现代纳米抗体的发现不仅越来越强调结合亲和力和特异性，还强调可开发性属性，如稳定性、溶解度和可制造性。
3.1 纳米抗体文库的构建
构建高质量的纳米抗体文库是成功分离功能性纳米抗体的基础步骤。根据VHH基因库来源的不同，纳米抗体文库通常分为免疫文库、天然文库以及合成或半合成文库。其中，免疫纳米抗体文库代表了最经典和经过广泛验证的策略。免疫文库是通过用确定的抗原免疫骆驼科动物，然后分离抗原特异性淋巴细胞并扩增VHH编码序列以构建文库而产生的。受益于生理免疫反应和体内亲和力成熟，源自免疫文库的纳米抗体通常表现出高亲和力和高特异性，使得这种方法特别适用于需要严格结合性能的应用。然而，免疫文库的构建劳动强度大、耗时且成本高，其成功受到宿主免疫背景的限制。因此，针对有毒、免疫原性弱或高度保守抗原生成纳米抗体仍然具有挑战性。为了解决骆驼免疫相关的后勤和技术限制，最近开发了转基因小鼠平台，如LamaMice。这些系统利用成熟的鼠类基因工程技术产生功能性VHH库，能够快速、可扩展地生成针对广泛抗原的纳米抗体，包括严重急性呼吸综合征冠状病毒2（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2, SARS-CoV-2）等新兴病原体。此类平台显著扩展了基于免疫的纳米抗体发现的适用性，同时降低了操作障碍。
相比之下，天然纳米抗体文库是从未免疫骆驼科动物的内源性VHH库中构建的，因此不需要抗原暴露。这些所谓的“通用”文库在快速构建、广泛的靶标兼容性以及适合并行或多靶标筛选方面具有优势。然而，由于缺乏体内亲和力成熟，从天然文库中获得的结合剂通常表现出适度的初始亲和力。因此，通常需要非常大的文库（通常为109–1011个克隆）才能达到可接受的中标率，并且通常需要随后的体外亲和力成熟来改善结合性能。为了进一步增强灵活性、可扩展性和实验可控性，已经开发了合成和半合成纳米抗体文库。这些文库完全在体外构建，通常保留特征明确且稳定的框架区，同时在CDRs（特别是CDR3）中引入合理设计的多样性，以模拟体细胞超突变。由于合成文库不受动物免疫周期的约束，它们可以快速生成并扩展到超过109个克隆的规模，允许针对特定的抗原类别定制CDR结构。这种可编程性使得合成文库对于抗体工程和药物开发特别有吸引力。尽管如此，合成策略也带来了显著的挑战。在缺乏生理选择压力的情况下，初始结合剂通常表现出相对较低的亲和力，需要大量的优化。此外，不受限制的CDR随机化可能会产生大量不稳定或折叠不良的变体，导致聚集或溶解度问题。为了平衡多样性与可开发性，当代的合成和半合成文库设计越来越多地整合结构生物学见解、理性设计原则和计算方法（包括深度学习）来约束序列空间。这些策略能够在保留下游应用必需的良好生物物理特性的同时，实现对广泛抗原的识别。
3.2 纳米抗体的筛选
虽然文库构建定义了可访问的序列空间，但展示和筛选技术是将这种多样性转化为功能性纳米抗体的关键步骤。在可用的平台中，噬菌体展示已成为纳米抗体筛选的黄金标准，因为它具有稳健性、可扩展性和操作成熟度。在噬菌体展示系统中，VHH基因与丝状噬菌体（如M13）的次要衣壳蛋白pIII融合，从而在基因型和表型之间建立了直接联系。可以高效地筛选通常范围为109至1011个克隆的超大型文库，通过迭代的生物淘选（Biopanning）富集高亲和力和高特异性的结合剂。噬菌体展示提供了几个实际优势，包括易于文库构建、低成本和高遗传稳定性，因此被广泛用于纳米抗体的初级筛选。然而，噬菌体展示依赖于大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）作为表达宿主，这对结构复杂的蛋白质构成了重大限制。原核宿主缺乏真核伴侣网络，无法执行复杂的翻译后修饰（Post-Translational Modifications, PTMs），如糖基化。虽然单体纳米抗体本身很少需要糖基化，因为缺乏Fc结构域，但当筛选格式化为复杂融合蛋白的纳米抗体，或筛选过程涉及展示复杂的、高度糖基化的靶抗原时，缺乏真核加工环境就会成为问题。
为了解决这些限制，真核细胞表面展示技术，特别是酵母和哺乳动物展示系统，发挥了必不可少的补充作用。酵母表面展示通常采用α-凝集素粘附受体1/2（Alpha-Agglutinin Adhesion Receptor 1/2, Aga1/Aga2）锚定系统将纳米抗体呈现在细胞壁上，提供更接近真核细胞的折叠环境。该平台能够选择识别天然蛋白质构象的结合剂，并允许使用荧光激活细胞分选（Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS）进行定量亲和力区分，在亲和力成熟和结合特性微调方面具有显著优势。然而，由于酵母细胞转化效率的限制，酵母展示文库的多样性相对较低（约108个变体），可能会限制鉴定高亲和力纳米抗体的机会。基于人胚胎肾293（Human Embryonic Kidney 293, HEK293）、中国仓鼠卵巢（Chinese Hamster Ovary, CHO）及相关细胞系的哺乳动物细胞展示系统进一步逼近人类生理条件，支持天然折叠和PTMs。这些系统对于筛选针对复杂、多结构域或膜相关蛋白质的纳米抗体特别有价值，并允许同时优化亲和力、特异性和表达水平。因此，哺乳动物展示是噬菌体和酵母平台的强大补充，特别是在后期候选物优化期间。最初，通过哺乳动物细胞展示只能实现相对较小的文库（最多107个克隆），然而最近的进展通过使用来自动物免疫的文库在很大程度上克服了这个问题。除了文库大小，宿主系统的选择从根本上影响所得纳米抗体文库的生化和折叠质量。因为纳米抗体必须穿过宿主的分泌途径才能在表面展示，宿主生物充当了内在的生物学过滤器。噬菌体展示技术能够分离高亲和力结合剂，但在识别功能性克隆（例如构象选择性纳米抗体）方面仍然存在挑战，尽管有一些成功的案例。相比之下，真核宿主使纳米抗体文库经受严格的质量控制机制，能够实现正确的PTM和显示的蛋白质具有天然的生物学功能形式。因此，酵母和哺乳动物展示系统积极过滤掉易聚集的变体，从本质上丰富了具有卓越稳定性、正确折叠和优异可开发性特征的纳米抗体文库。
总之，噬菌体展示系统是无与伦比的初级命中发现平台，提供了超大型文库所需的吞吐量。然而，它们对原核或体外环境的依赖限制了它们执行复杂PTMs的能力，并且它们的基本折叠机制可能无法正确显示或过滤结构复杂的结合剂。相比之下，真核平台，特别是酵母和哺乳动物展示，解决了这些瓶颈。虽然它们受限于较小的文库规模，但它们进行天然折叠和复杂PTMs的能力使其对于需要真正生理背景的靶标至关重要。最终，没有一个单一的平台是普遍优越的。现代纳米抗体的发现在使用分层管道时最为有效，该管道利用噬菌体展示的大规模吞吐量进行初始分离，随后利用酵母或哺乳动物系统的高质量过滤环境进行亲和力成熟和可开发性优化。除了这些主流方法外，细菌表面展示和无细胞展示技术在特定情况下提供了有用的替代方案。细菌展示能够以低成本实现高水平表面表达，但受限于缺乏真核PTMs。无细胞系统，包括核糖体展示和mRNA展示，完全将筛选与细胞限制解耦，并允许探索达到1012–1014个克隆的超大型文库。这些平台特别适合需要广泛诱变的早期发现和定向进化活动。然而，缺乏天然折叠伴侣和修饰机制可能对结构复杂的靶标构成挑战。这些展示技术共同形成了一个互补且连续的筛选管道，从高通量的初级选择到精细的亲和力优化，从而实现纳米抗体的高效发现和工程化。
3.3 纳米抗体的表达系统
高质量纳米抗体的生产关键取决于表达系统的选择。原核表达——主要在大肠杆菌中——长期以来一直被认为是实验室规模纳米抗体生产的黄金标准，因为其遗传学特征明确、易于操作、生长速度快且成本低。由于纳米抗体缺乏Fc相关的N连接糖基化，它们特别适合细菌表达。周质表达利用氧化环境促进二硫键的形成，而细胞质表达可以产生非常高的蛋白质水平，尽管通常需要从包涵体中复性。尽管具有这些优势，细菌系统在支持复杂PTMs方面的能力有限。酵母表达系统，如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和毕赤酵母（Pichia pastoris），通过结合微生物可扩展性和部分真核加工能力提供了一种中间解决方案。特别是毕赤酵母提供了强启动子、高密度发酵和有效分泌正确折叠的纳米抗体，简化了下游纯化，使其成为工业规模生产的有吸引力的平台。然而，酵母特异性糖基化模式与人类不同，对于某些应用需要宿主工程或工艺优化。对于需要天然构象和精确PTMs的应用，基于CHO或HEK293细胞的哺乳动物表达系统仍然是不可或缺的。这些系统最接近人类细胞加工途径，能够实现准确的糖基化、磷酸化和二硫键形成。因此，哺乳动物细胞是生产复杂纳米抗体构建体（如纳米抗体-Fc或纳米抗体-酶融合蛋白）以及用于医疗或高灵敏度诊断用途的临床级产品的首选平台。虽然哺乳动物表达与较高的成本、较长的生产周期和较低的产量相关，但其在生物相容性和功能保真度方面的优势仍然无可匹敌。除了这些主流系统外，植物、昆虫和无细胞表达系统等替代平台在小众应用中显示出潜力。植物基表达提供了可扩展的生产并降低了生物安全风险，但可能引入引起免疫原性担忧的非人类糖基化模式。昆虫细胞-杆状病毒系统提供了中等的PTM能力和可扩展的生产，但涉及相对复杂的工作流程和异质性糖基化。无细胞表达系统能够在数小时内实现蛋白质合成，并提供对折叠环境的精确控制，使其对于快速筛选和应急响应应用特别有吸引力。尽管目前的产量和修饰能力仍然有限，但持续的技术进步有望增强其作为补充生产平台的实用性。
4 纳米抗体的应用
凭借其小尺寸、高亲和力、卓越的稳定性和易于模块化工程的特点，纳米抗体已被广泛应用于诊断和治疗领域。与传统mAbs相比，纳米抗体在需要快速组织渗透、进入空间受限的表位、灵活的分子格式化或成本效益高的生产的环境中提供了明显的优势。
4.1 诊断应用
4.1.1 体外诊断
在体外诊断中，纳米抗体主要用作酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）、侧向层析免疫测定（Lateral Flow Immunoassay, LFIA）和生物传感器等平台的高性能识别元件。其小分子尺寸、高亲和力、优异的理化稳定性和易于基因或化学修饰的特性显著提高了测定的灵敏度、特异性和稳健性，特别是在复杂的样品基质中。因此，纳米抗体日益被视为下一代诊断试剂的关键组成部分。
4.1.1.1 病毒检测
纳米抗体已成功应用于诺如病毒和冠状病毒的检测。一种用于诺如病毒检测的基于纳米抗体的LFIA，在代表性抗原中实现了约80%的灵敏度和86%的特异性，证明了尽管病毒突变率高，但仍适用于快速筛查。对于SARS-CoV-2，识别刺突蛋白保守表位的纳米抗体能够通过ELISA、LFIA、流式细胞术、显微镜和Western blot平台对包括Omicron在内的多个关注变体进行稳健的定量检测。与此同时，靶向SARS-CoV-2核衣壳蛋白和刺突蛋白的纳米抗体ELISA分别实现了ng/mL至pg/mL水平的检测限，能够对临床鼻拭子样本和灭活病毒制剂进行灵敏分析。这些研究共同突出了纳米抗体在病毒诊断中结合广谱识别和高度分析灵敏度的能力。
4.1.1.2 细菌检测
基于纳米抗体的检测方法已广泛应用于细菌病原体和毒素的检测，显著改善了传统免疫测定的性能。靶向肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的纳米抗体夹心ELISA能够在牛奶中进行快速灵敏的检测，通过富集步骤可以以极低水平监测污染。在毒素检测中，纳米抗体-酶融合策略缩短了测定时间并提高了灵敏度，同时避免了传统化学偶联的不稳定性，用于检测葡萄球菌肠毒素B。其他针对致病性大肠杆菌菌株和脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）毒素的纳米抗体检测方法也有报道。这些研究共同强调了纳米抗体在细菌诊断中的高亲和力、工程灵活性和平台兼容性，特别是对于食品安全和临床监测。
4.1.1.3 寄生虫检测
纳米抗体在寄生虫病诊断中也显示出优势。在非洲动物锥虫病中，识别刚果锥虫（Trypanosoma congolense）丙酮酸激酶的纳米抗体对用于建立夹心ELISA，随后转化为LFIA格式，在血浆样本中实现了超过80%的灵敏度和特异性。在兽医诊断中，靶向口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的纳米抗体夹心ELISA实现了牲畜的大规模血清学监测。这些例子说明了纳米抗体检测在实验室和现场寄生虫检测中的适应性。
4.1.1.4 毒素检测
在食品和环境安全监测中，结合LFIA和高灵敏度ELISA平台的纳米抗体实现了对毒素和小分子污染物的快速现场检测。靶向黄曲霉毒素B1的纳米抗体LFIA在复杂的植物源性基质中表现出可靠的性能，而针对农药代谢物的检测方法已成功应用于乳制品和环境水样。先进的纳米抗体-报告基因融合形式进一步实现了沉积物和谷物中持久性有机污染物的超灵敏检测，提供了改进的基质干扰耐受性和简化的工作流程。
4.1.1.5 其他小分子及生物标志物检测
纳米抗体在检测肿瘤生物标志物、神经退行性疾病标志物和医药产品方面显示出广泛的实用性。高灵敏度的纳米抗体检测方法实现了对肝癌相关蛋白如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（Glypican-3）和癌胚抗原（Carcinoembryonic Antigen, CEA）的痕量水平检测，灵敏度提高了几个数量级。在神经系统疾病中，基于纳米抗体的方法促进了淀粉样蛋白-β（Amyloid-beta protein, Aβ）和tau蛋白的快速检测，为早期诊断和疾病监测提供了工具。纳米抗体还被纳入便携式测定中用于药品质量控制，能够快识别假冒或劣质生物制品。这些应用凸显了纳米抗体在小分子和生物标志物检测中的多功能性。
4.1.2 体内诊断
纳米抗体已成为体内分子成像的强大靶向配体。其小尺寸、优异的组织渗透性、快速的血液清除率和易于标记的特点允许与放射性核素、荧光染料、磁共振造影剂以及超声微泡结合，实现对肿瘤、心血管疾病和神经系统疾病的无创可视化。
4.1.2.1 单光子发射计算机断层扫描/正电子发射断层扫描（SPECT/PET）
标记为99mTc、111In、177Lu、18F、68Ga和89Zr等放射性核素的纳米抗体探针在SPECT和PET成像中表现出高灵敏度和特异性。包括表皮生长因子受体2（Human Epidermal Growth Factor Receptor 2, HER2）、表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR）、PD-L1和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated Protein 4, CTLA-4）在内的靶点已成功可视化，与传统抗体相比具有更优的信噪比。虽然SPECT以相对较低的成本提供深层组织成像，但PET提供更高的空间分辨率和动态成像能力。重要的是，基于纳米抗体的PET和SPECT探针已从临床前模型推进到早期临床研究，证明了其在癌症诊断和治疗监测方面的安全性和转化可行性。
4.1.2.2 光学成像
与近红外染料结合的纳米抗体能够对肿瘤相关抗原进行高特异性光学成像，包括HER2、EGFR和CEA。在结直肠癌和胰腺癌的患者来源异种移植小鼠模型中，这些探针表现出快速的肿瘤靶向动力学和优异的信噪比，使其不仅适用于快速肿瘤定位和成像，还适用于图像引导手术期间的实时肿瘤边缘描绘。此外，通过与绿色荧光蛋白等荧光蛋白融合或用其他荧光染料标记，纳米抗体探针的应用已广泛扩展到实时细胞成像、蛋白质-蛋白质相互作用和电化学生物传感研究中。尽管光学成像受组织穿透深度的限制，但基于纳米抗体的探针在微创诊断和手术导航中显示出巨大潜力。
4.1.2.3 磁共振成像（MRI）和超声成像
在MRI中，功能化四氧化三铁纳米颗粒的抗间皮素纳米抗体能够实现对卵巢癌的靶向成像。纳米抗体也可以与MR造影剂结合作为检测Aβ的探针。此外，当与PET结合时，基于纳米抗体的示踪剂进一步促进了对动脉粥样硬化和心肌梗死相关炎症特征的多参数PET/MRI表型分析。在超声成像中，将纳米抗体偶联到微泡表面可以显著提高成像特异性。纳米抗体修饰的微泡增强了对动脉粥样硬化斑块中血管细胞粘附分子-1等血管靶点的分子成像。虽然MRI提供高空间分辨率，超声允许实时成像，但纳米抗体靶向大大扩展了这两种模式的分子特异性，特别是在神经系统、心血管和肿瘤学应用中。
4.2 治疗应用
4.2.1 纳米抗体为基础的肿瘤免疫治疗
尽管基于mAb的免疫治疗取得了成功，但有限的肿瘤渗透性、免疫原性和高生产成本等挑战仍然存在，特别是在实体瘤中。纳米抗体凭借其小尺寸和卓越的工程化能力，为下一代肿瘤免疫治疗提供了多功能构建模块。目前的策略主要包括多价纳米抗体、纳米抗体-药物偶联物（Nanobody-Drug Conjugates, NDCs）、基于纳米抗体的嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）-T细胞和纳米抗体功能化纳米颗粒。
4.2.1.1 多价纳米抗体
多价纳米抗体由两个或多个串联连接的VHH结构域组成，增强了亲合力并能够同时靶向多个抗原。这种设计减少了免疫逃逸并提高了抗肿瘤疗效。最近的研究突出了这一策略的治疗潜力。例如，双特异性纳米抗体BI 836880同时阻断血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF）和血管生成素-2（Angiopoietin-2, Ang2），在肺腺癌脑转移中显示出强大的疗效。同样，Deken等人报道了一种HER2特异性双互补位纳米抗体（1D5–18A12），与单价对应物相比，在曲妥珠单抗耐药模型中显示出更优的受体内吞和肿瘤消退。创新设计如半衰期延长的CD38特异性纳米抗体双特异性杀伤细胞衔接器（Half-Life Extended nano-Bispecific Killer cell Engagers, HLE-nano-BiKEs）和CD47/CD20双特异性融合蛋白也显示出增强的细胞毒性和先天免疫参与，在临床前模型中超越了传统的mAbs如daratumumab和rituximab。这些研究表明，多价和多特异性纳米抗体工程可以通过协调调节多种肿瘤相关通路来放大抗肿瘤疗效。
4.2.1.2 纳米抗体-药物偶联物
NDCs将纳米抗体的靶向精度与小分子药物或毒素的细胞毒性效力相结合
