综述：二维材料在侧向层析免疫分析中的功能角色与转化挑战：一项批判性综述

《VIEW》：Two-Dimensional Materials For Lateral Flow Assays: A Critical Review of Functional Roles and Translational Challenges

　　

侧向层析免疫分析（LFA）被广泛应用于即时检测（POCT）诊断领域，但其检测能力仍受限于分子固定化（molecule immobilization）效率低下、传统标记物信号输出微弱以及缺乏新型放大机制等问题。本综述首先简要阐述了LFA的基本原理及当前关键操作模式，随后以功能为中心的系统框架分析了二维（2D）材料如何克服上述局限性。在LFA背景下，研究人员将2D材料的贡献按机制角色分为以下几类：利用本征光学性质作为高对比度信号报告元件（reporters）、作为实现高密度生物分子负载的信号支架（scaffolds）、作为实现显著灵敏度提升的催化放大器，以及作为信号转换的基底。除现有应用外，研究人员识别了2D材料用于LFA的关键挑战及尚未充分探索的机遇，包括2D材料功能化纤维和膜的结构优化，以及具有独特功能特性的新兴2D成员对下一代LFA模式的潜在推动作用。本工作为材料-生物传感整合提供了批判性综合，为将2D材料优势转化为临床可行的LFA平台提供了实用设计准则。

2 LFA的演进：从标准模式到先进模式

2.1 LFA的基本原理

LFA检测体系的核心原理基于固定在试纸条上的抗体与抗原之间的特异性相互作用。LFA试纸条通常由样品垫、结合垫、检测垫（主要为硝酸纤维素膜，即NC膜）和吸水垫组成。检测过程中，膜结构作为功能性和结构性平台，利用毛细作用驱动载有颗粒的样品溶液流动；迁移过程中，样品中的目标物与生物活性元件（抗原/抗体/核酸适配体等）发生特异性结合；最终，两种或多种不同生物活性元件修饰的标记物被固定在检测膜上，形成检测线（T线）和控制线（C线）。目前LFA主要采用两种生物传感原理：三明治夹心免疫分析法和竞争（免疫）分析法。三明治法主要用于大分子检测，采用双抗体系统，信号强度与抗原浓度呈正相关；竞争法则适用于低分子量、单表位化合物，目标抗原与标记抗原竞争有限的抗体结合位点，信号强度与目标物浓度呈负相关。

2.2 LFA的检测模式

2.2.1 裸眼可视模式LFA

裸眼比色LFA是一种高度便捷、快速的检测技术。胶体金纳米颗粒（AuNPs）是最常用的标记物，因其优异的蛋白吸附能力、可调的尺寸分布、低成本及直接的视觉可读性。研究人员通过AuNP-生物素/抗体和AuNP-链霉亲和素偶联物设计双AuNP系统，并探索激光烧蚀法制备的AuNPs等功能化策略。除AuNPs外，银纳米颗粒（AgNPs）及核壳结构的Au@Ag颗粒、彩色乳胶颗粒等也被开发用于提升检测性能。

2.2.2 荧光LFA

荧光LFA通过掺入有机荧光团或量子点等荧光标记材料，依赖特定激发下的发射光放大检测信号，实现敏感的定性或定量分析。但该模式受环境敏感的淬灭效应、微球分散性相关的信号均一性问题、某些染料的细胞毒性以及外部激发组件导致设备体积增大等因素制约。

2.2.3 化学发光LFA

化学发光LFA利用特定化学反应过程产生可检测光信号的高灵敏度反应，通过抗原-抗体相互作用增强分析物检测。与传统底物依赖型化学发光不同，电化学发光（ECL）LFA提供更高的灵敏度、更宽的线性范围和增强的信号可控性。

2.2.4 表面增强拉曼散射（SERS）LFA

SERS-LFA利用SERS活性标记物产生的超灵敏、指纹式拉曼信号实现高度特异性检测。然而，与荧光系统类似，SERS集成LFA因所需光学硬件不可避免地导致设备体积增大。

2.2.5 其他LFA模式

其他创新策略包括纳米酶辅助LFA、光热LFA、微针辅助电化学LFA、磁响应LFA以及口罩集成传感器等。其中，纳米酶凭借其类酶催化活性实现pg/mL级别的癌症标志物检测，灵敏度较传统AuNP-LFA提高两个数量级。

3 2D材料与LFA的新兴整合

3.1 高对比度信号报告元件

石墨烯是最早应用于LFA系统的2D材料之一，展现出替代AuNP标记物的强大潜力。Huang等研究人员在竞争法LFA中采用石墨烯标记合成抗原，石墨烯-抗原偶联物与目标分析物竞争抗体结合位点；石墨烯的强光学对比度和高负载容量实现了0.1 ng/mL的最低目视检测浓度。MoS₂纳米片也被证实可作为高容量抗体载体和强比色报告元件，通过致密探针负载和增强光学对比度的协同效应，较传统AuNP-LFA实现17倍更低的检测限。此外，功能化WS₂纳米片可通过葡聚糖介导的聚糖-凝集素识别发挥抗体模拟物和信号报告元件的双重作用，无需传统抗体标记即可实现比色可视化及定量拉曼检测。

3.2 复合支架

除直接作为T/C线信号报告元件外，2D材料还可作为高表面积支架负载其他信号标签，通过功能富集实现信号放大。MXene（特别是Ti₃C₂T_x）因其快速制备、活性层表面及稳定尺寸分布而展现出巨大潜力。Deng等研究人员制备了MXene-Au纳米复合材料用于动物源性食品中地塞米松的双模式LFA检测，通过Au NPs与MXene基底之间的协同等离子体-电子耦合及高效界面电荷转移，实现比色"关闭"模式和荧光"开启"模式的LOD大幅优化。Zheng等研究人员构建了负载大量量子点的MoS₂@QD双模式LFA，其中MoS₂不仅作为被动载体，更作为2D支架空间浓缩荧光团同时抑制背景干扰。将2D MoS₂纳米片工程化为3D花状结构并修饰单宁酸，可创建高效偶联抗体的多功能支架，同时实现比色和光热双模式检测。类似地，石墨烯衍生材料如GO介导的预LFA富集微平台、Au-rGO、CdSe/ZnS QDs-超薄GO、磁性QDs修饰GO及荧光DNA探针吸附GO等也充分 exemplified 了2D支架机制。

3.3 催化信号放大

催化信号放大是2D材料基LFA系统的另一关键机制。Lin等研究人员开发了Ti₃C₂T_x@Pt双信号LFA，锚定在MXene纳米片上的Pt NPs表现出强过氧化物酶样活性，对氯霉素的检测限达0.01 μg/kg，约为常规检测方法的50倍。Tan等研究人员制备了具有与辣根过氧化物酶（HRP）相当催化活性的MXene@PtCu纳米酶，在B. pseudomallei来源胞外囊泡分析中实现了15 fM的视觉检测限。Luo等研究人员通过一步自还原法制备Pt/Ti₃C₂T_x，每个纳米颗粒含有大量Pt NPs带来催化效应，展现出增强的比色信号和优异的模拟酶活性及优越的LFA性能。此外，Fe₃O₄@MoS₂@Pt三相集成纳米材料同时具有过氧化物酶样活性和光热性质，可通过催化H₂O₂分解产生超氧自由基，氧化TMB产生蓝色比色信号实现催化放大。

3.4 信号转导

2D材料还可作为LFA的功能性基底发挥作用。Ge等研究人员采用电化学阴极剥离NbSe₂作为SERS基底，在0.01至100 ng/mL宽范围内检测泪液中的基质金属蛋白酶-9，灵敏度超越ELISA方法。Enric等研究人员证明石墨烯可作为核心电化学电极材料，直接、无缝、可扩展地集成到NC基LFA试纸条上，提供高导电性、大电活性表面积及与纸质微流控的机械兼容性，实现光学-电化学双模式定量检测。此外，GO/Au NPs复合材料固定于T线可作为自校准SERS-LFA的内标，GO的特征拉曼峰提供稳定参考信号，实现比值的定量分析，LOD较常规SERS-LFA降低3.5倍，重复性提高1.65倍。石墨烯还可作为荧光猝灭剂和信号开发元件，通过FRET机制在缺乏目标物时猝灭抗体偶联量子点的荧光（OFF状态），而在病原体结合后因供体-受体距离增加保留荧光（ON状态）。

4 挑战与展望

4.1 界面物理与流体学障碍

理想的LFA要求纳米片标记物能在NC膜中顺畅流动而不堵塞。与球形AuNPs相比，纳米片在流动过程中承受不同的力，过大的纳米片可能停滞流动，过小的纳米片则可能因流速过快而影响结合。纳米片几何形状和表面化学对LFA流动行为的影响尚需系统研究。Washburn方程（L² = (γDt)/4μ）可用于指导流动行为分析，但2D材料的流动特性数据仍显不足。此外，结合垫释放效率、2D材料在磷酸盐缓冲液和复杂生物流体中的均匀分散性，以及部分聚集体在样品垫-检测膜连接处的滞留问题，均需通过合理的表面功能化和探针制备加以优化。

4.2 2D材料的合成、结构设计与表面修饰

LFA性能高度依赖2D材料的质量和一致性。机械剥离法产率高质但产量仅微克级，难以规模化；化学气相沉积（CVD）可制备大面积均匀单层，但需500-1000°C高温和专用设备；熔盐辅助剥离法在质量与可扩展性间取得平衡，数分钟内即可获得可控厚度的纳米片；液相剥离法则因与LFA一次性、溶液基、低成本诊断平台的高度兼容性而被广泛采用，可实现克级生产并直接获得适于抗体偶联和NC膜流动的胶体分散体。表面缺陷和含氧基团为生物分子固定提供锚定位点，但非特异性吸附需优化表面状态。PEG涂层可抑制背景信号，但过量PEG会阻碍抗体接近。Langmuir模型可辅助2D材料标记的理性设计。合成可扩展性和成本效益亦是实际障碍，大多数高质量2D材料依赖专业低产方法或危险试剂，导致生产成本高昂和环境风险。

4.3 2D材料用于纤维和膜

LFA的结构组件目前仍以传统材料为基础，未能充分发挥2D材料的潜力。将GO涂层于NC膜表面可将捕获抗体集中于表面而非孔隙内部，使免疫复合物更接近读取器，荧光强度提高2-3倍，实现11.1 pg/mL的LOD。通过静电纺丝或模板法将2D材料整合入纤维和膜，可调节孔径优化毛细流动、增加抗体固定化位点，甚至作为直接信号转导通道。PMMA基膜与2D材料的组合已在催化、过滤和能源应用中验证了其孔隙率和功能性。

4.4 先进2D特性的利用

当前LFA研究对2D材料的利用严重不足，多数应用仅利用其高表面积进行抗体负载或简单光学标记。MoS₂的厚度依赖带隙、双晶相（2H和1T）及荧光开关特性，MXene的金属导电性、亲水性、氧化还原活性、磁序和微波响应等独特性质，在LFA中尚未充分开发。许多其他2D成员如TMDs（WSe₂、MoTe₂）、Ti₃CNT_x MXene、黑磷、h-BN、2D金属、2D钙钛矿、硅烷及2D拓扑绝缘体等在LFA中仍有待探索。便携式/可穿戴设备的发展为2D材料实现实时、非侵入性监测创造了机遇，其优异的机械性能（尤其是沿面内方向的变形性能）具有重要优势，但需仔细验证其在LFA基可穿戴设备中的柔性和可靠性。

5 结论

本综述系统评估了2D材料与LFA的整合，从LFA基本原理和模式的讨论过渡到2D纳米材料的关键作用。值得注意的是，2D材料通过作为高对比度信号报告元件阈门、高容量支架、催化放大器和活性信号转换器，超越了传统灵敏度瓶颈。除现有策略外，LFA结构组件（如纤维和膜）的功能化以及新兴2D成员的探索被认定为下一代LFA诊断的关键前沿。石墨烯和MoS₂展现出超越商业AuNPs或乳胶基比色LFA试纸条的显著潜力；MXene以其大表面积为其他多样化纳米标签提供平台。然而，要实现从实验室研究到实际应用的转化，必须解决界面流体学、合成与稳定性、特性利用以及结构创新等方面的挑战。