基于PureCap加帽法的硫代修饰对mRNA翻译的影响

《RSC Chemical Biology》：Thio-modification effects on mRNA translation using a PureCap-based capping method

　　

控制翻译效率、稳定性及先天免疫识别是mRNA治疗实际应用中的关键挑战，化学修饰核酸被广泛用作解决这些问题的有效策略。以4′-硫代取代为代表的糖修饰和以磷硫酰化（PS）取代为代表的磷酸骨架修饰能够改变核酸的行为。在本研究中，为在mRNA 5′端+1和+2核苷酸处引入4′-硫代取代和PS取代，研究人员基于先前建立的PureCap方法合成了一系列帽类似物，该方法可制备高纯度加帽mRNA以可靠评估帽修饰效应。利用所得帽类似物，通过体外转录（IVT）结合高效液相色谱（HPLC）纯化制备mRNA，即使核糖部位引入修饰，IVT产量也未显著降低。在培养的HeLa细胞中，对于Cap 0、Cap 1和Cap 2结构，PS修饰mRNA的蛋白表达均高于相应的4′-硫代修饰对应物。相比之下，对于Cap 2结构，PureCap来源的携带4′-硫代或PS修饰的mRNA在基于细胞的翻译实验中72小时以及小鼠皮下给药后各测量时间点的蛋白表达，均与使用商业化CleanCap AG制备的N1-甲基假尿苷（m¹Ψ）修饰对照mRNA相当。综上所述，这些结果表明5′端+1和+2核苷酸处的4′-硫代和PS修饰能够改变mRNA功能。该工作进一步证明了PureCap平台的实用性，并突出了其在mRNA治疗开发中的广泛应用前景。

研究背景与问题提出

核酸治疗作为一种新型治疗方式具有光明前景，然而提高其效率、稳定性及免疫识别特性仍需大量努力。化学修饰已成为应对这些挑战的重要策略。硫（S）与氧（O）同属氧族元素，但硫具有更大的原子半径和更低的电负性，这些特性可改变核酸的化学行为。此类元素取代也存在于自然界：转运RNA（tRNA）携带多种含硫修饰，包括4-硫尿苷（s⁴U）和2-硫尿苷（s²U）。其中s²U已知可抑制翻译过程中的错码，s⁴U则被报道可增强tRNA稳定性。另一著名的硫修饰是磷硫酰化（PS）修饰，即核酸骨架磷酸基团的非桥氧原子被硫取代，该修饰已在细菌和古菌DNA中自然存在。PS修饰现广泛应用于合成核酸和核酸治疗中，可提高核酸酶抗性和药代动力学性质，已成为反义寡核苷酸（ASO）和小干扰RNA（siRNA）治疗的标准技术，并在多种美国FDA批准药物如Nusinersen和Inclisiran中得到验证。

基于这些寡核苷酸治疗的成功经验，PS修饰在mRNA中的应用也有所进展。研究人员此前的工作表明，将PS引入合成核酸可加速无细胞翻译系统中的翻译起始并显著增强翻译效率，提示该修饰对mRNA治疗具有潜在应用价值。作为另一氧-硫取代实例，4′-硫代修饰核酸中核糖的环氧原子被硫取代，正逐渐在下一代核酸治疗开发中占据重要地位。氧-硫取代不仅通过C-S键伸长和电子结构变化扰乱核糖环二面角，还影响S4′-C1′-N异头效应，从而提高热稳定性并增强核酸酶抗性。先前研究的结构分析表明，4′-硫代RNA优先采取与天然RNA相同的C3′-endo核糖折叠构象，并可与互补RNA链维持双链形成。随着合成技术的进步，包括生物催化剂一锅合成平台和手选择性化学合成等可扩展方法的出现，4′-硫核苷的规模化制备得以实现，其在siRNA、基因组编辑及抗病毒药物等领域的应用也日趋广泛。

mRNA治疗是通过在体内诱导治疗性蛋白产生的治疗方式，继COVID-19疫苗成功之后，其应用已扩展至抗癌治疗和蛋白替代治疗等广泛医疗领域。mRNA由5′帽、非翻译区（UTR）、编码区和poly(A)尾组成。5′帽含有N7-甲基鸟苷（m⁷G）结构，通过5′-5′三磷酸桥与mRNA链连接。根据第一转录核苷酸（+1）和第二核苷酸（+2）上2′-O-甲基化的有无，帽结构分为Cap 0、Cap 1或Cap 2。5′帽被真核翻译起始因子4E（eIF4E）、脱帽酶（如脱帽蛋白Dcp、脱帽清除因子DcpS和脱帽外核糖核酸酶DXO）以及免疫相关蛋白如IFIT蛋白和RIG-I识别，因此在翻译起始、mRNA稳定性调控和免疫应答中发挥核心作用。然而，传统共转录加帽方法仍无法生产定量加帽的所有结构变体mRNA，这一限制使得准确评估化学修饰效应变得困难。为应对这一问题，研究人员开发了PureCap方法，该方法通过在帽类似物的m⁷G部位引入疏水标签，实现加帽mRNA与未加帽mRNA的物理化学分离，可获得纯度高于99%的加帽mRNA。

尽管4′-硫代和PS修饰已被证明可有效调控核酸分子功能，但将这些修饰引入mRNA帽结构的研究仍然有限。此外，虽然+1和+2位置修饰对翻译效率的影响已有部分报道，但所检测的修饰类型受限。由于该区域受翻译控制、先天免疫应答和mRNA代谢等多种因素调控，在这些位置引入基于硫的修饰有望为精确控制mRNA功能提供新策略。

研究设计与技术方法

本研究利用PureCap方法，设计并合成了在糖环（4′S修饰）和骨架（PS修饰）+1和+2位置携带此前未探索的硫取代的帽类似物，系统研究了其对IVT产量、加帽效率以及细胞和体内翻译效率的影响。关键技术方法包括：（1）基于PureCap平台的帽类似物设计与合成，采用溶液相合成法和自动化寡核苷酸合成仪制备三核苷酸，再与带疏水标签的加帽试剂偶联；（2）T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）介导的IVT反应，使用675 bp双链DNA模板（编码NanoLuc荧光素酶Nluc），通过RP-HPLC分离纯化加帽mRNA，光照射去除疏水标签；（3）变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（dPAGE）验证mRNA长度完整性，点印迹分析双链RNA（dsRNA）含量；（4）使用Lipofectamine MessengerMAX试剂将mRNA转染HeLa细胞，在6、24、48、72小时测量荧光素酶活性；（5）脂质纳米颗粒（LNP）封装（快速混合法）及小鼠皮下给药模型，2 μg mRNA/只，在6、24、48小时进行体内成像分析；（6）统计学分析采用单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey多重比较检验。

研究结果

帽类似物的设计与合成

基于先前研究对Cap 0、Cap 1和Cap 2结构翻译效率的比较评估，研究人员设计了两个系列的硫代修饰帽类似物：4′S系列（1-3）和PS系列（4-6），并在每个系列中合成了Cap 0、Cap 1和Cap 2结构。为最小化变量，所有帽类似物均在+1和+2位置同时引入硫代修饰。同时合成了相应的未修饰对照系列（UnMod系列）Cap 0（7）、Cap 1（8）和Cap 2（9）作为对照。PureCap类似物通过带疏水标签的加帽试剂（10）与相应三核苷酸（11-19）偶联合成。三核苷酸的制备根据所需规模和试剂可得性，采用溶液相法或DNA/RNA寡核苷酸合成仪。在化合物11-13的溶液相合成中，以2',3'-保护鸟苷为底物，1H-四唑为活化剂，在乙腈中实现5'-选择性偶联；对于反应效率较低的化合物28-30合成，将溶剂体系改为二氯乙烷/乙腈混合溶剂显著改善了反应效率。PS和UnMod系列三核苷酸采用自动化寡核苷酸合成仪合成，使用DDTT作为硫化试剂。所有修饰帽类似物的最终偶联收率为7%-30%，纯度高于95%。

IVT与mRNA样品制备

为评估修饰PureCap类似物在IVT中作为底物的适用性，研究人员通过RP-HPLC检测加帽与未加帽mRNA的两个清晰分离峰，通过与标准曲线比较定量测定mRNA量和加帽效率。结果显示，4′S修饰帽类似物的产量略低于相同帽结构（Cap 0、Cap 1和Cap 2）的PS和UnMod系列对应物；特别是使用化合物3制备mRNA时，加帽RNA产量分别降至PS型化合物6和UnMod型化合物9所得产量的约64%和60%。尽管产量有所降低，所有数值仍在可接受范围内，确认这些类似物可作为T7 RNAP的底物。相比之下，所有PureCap类似物的加帽效率相当，4′S系列为82-85%，PS系列为80-81%，UnMod系列为85-89%，表明这些化学修饰在当前反应条件下对加帽效率无显著影响。经HPLC纯化和光照去除疏水标签后，通过dPAGE确认纯化mRNA的长度和完整性，点印迹分析显示所有PureCap mRNA的dsRNA含量无显著差异。

体外与体内翻译效率

将制备的Nluc mRNA转染HeLa细胞后，在6、24、48和72小时测量荧光素酶表达以评估翻译活性。首先比较各帽类（Cap 0、Cap 1和Cap 2）内4′S、PS和UnMod变体的翻译活性：Cap 0 mRNA中，PS_Cap 0蛋白表达高于相应未修饰类似物，而4′S_Cap 0在各时间点表达较低；Cap 1 mRNA在24、48和72小时呈现相似趋势。Cap 2系列中，PS_Cap 2与未修饰类似物在各时间点无显著差异，而4′S_Cap 2再次低于未修饰类似物。然而，4′S_Cap 2、PS_Cap 2和UnMod_Cap 2在72小时与CleanCap_m¹Ψ相比均无显著差异。比较各修饰系列内Cap 0、Cap 1和Cap 2结构的影响：PS系列中PS_Cap 1在24、48和72小时表达高于PS_Cap 0和PS_Cap 2；UnMod系列中仅UnMod_Cap 2在24小时表达更高；4′S系列三种帽结构间无明显差异。总体而言，化学修饰本身的影响大于帽结构的影响。

体内实验选择基于先前发现体内Cap 2结构比Cap 0和Cap 1具有更高翻译活性的结果，将Cap 2 mRNA封装于LNP中。所有mRNA在相同LNP制备条件下配制，具有可比的分散指数（PDI低于0.2）和包封效率（EE%超过90%）。mRNA-LNP以2 μg/只皮下给药后，在6、24和48小时测量Nluc表达。体内发光成像显示，PureCap方法制备的mRNA（4′S_Cap 2、PS_Cap 2和UnMod_Cap 2）蛋白表达与CleanCap_m¹Ψ相当，尽管PureCap来源mRNA完全由天然尿苷组成而非全长度m¹Ψ。与体外结果不同，体内各时间点4′S_Cap 2、PS_Cap 2和UnMod_Cap 2间无统计学差异，表明帽结构中的氧-硫取代在体内可被接受。

讨论与结论

本研究利用PureCap技术向mRNA 5′端帽结构引入含硫修饰，设计并合成了在+1和+2位置携带不同修饰模式的帽类似物（4′S_PureCap和PS_PureCap），评估了以其制备的mRNA的翻译特性。

尽管已开发出多种帽结构化学修饰，但关于位点特异性修饰如何影响整体mRNA功能的研究仍有大量空间。许多先前研究集中于通过m⁷G部位修饰增强eIF4E结合亲和力，或靶向三磷酸部位提高抗降解能力。然而，超出这些已知修饰，系统研究三磷酸桥下游即+1和+2位置化学修饰对整体mRNA性质影响的工作仍然有限。+1核苷酸已被证明通过限制eIF4E C端环区的取向影响其识别；m⁶A等碱基修饰和2′-MOE、LNA等核糖修饰可增强翻译效率；m⁶Am修饰和Cap 2结构可更有效地抑制与IFIT蛋白的复合物形成，增强"自身"mRNA识别。另一方面，+1位置区域也是脱帽酶DXO的切割位点，因此帽及相邻核苷酸的化学修饰被认为参与mRNA稳定性调控。在此背景下，引入基于硫的修饰是调控mRNA稳定性、先天免疫识别和翻译活性的可能策略。

对于PS修饰，已报道其在mRNA 5′端引入的实例，邻近帽结构安装硫的优化可直接贡献于最大化mRNA功能。然而，先前工作采用化学加帽和酶连接的多步骤流程，而PureCap方法可在IVT反应中直接、定位特异性地引入PS修饰，提供更简单、更可重复的平台。对于4′-thio修饰，其在血清中具有高稳定性并易形成稳定双链，已应用于siRNA和Cas9向导序列，但本研究首次证明携带位点特异性4′-硫代核糖修饰且具有帽结构的mRNA可在细胞和体内维持高翻译活性。

结论部分指出，利用PureCap方法设计并合成了Cap 0、Cap 1和Cap 2型帽类似物，其+1和+2位置携带4′-硫代核糖或PS修饰，经IVT和HPLC纯化制备高纯度mRNA。尽管4′S系列IVT产量略有下降，但加帽效率得以保持。HeLa细胞翻译评估中，PS修饰mRNA（尤其是Cap 0和Cap 1型）表现出比UnMod和CleanCap_m¹Ψ对照更高的蛋白表达，而相应4′S修饰mRNA表达水平较低。然而，LNP封装和小鼠皮下给药后，4′S_Cap 2和PS_Cap 2在6至48小时各测量时间点均未显示蛋白表达显著降低。这些发现共同表明，帽近端+1和+2区域是独立于三磷酸部位的额外设计空间，在这些位置安装含硫修饰可在保持翻译性能的同时调控mRNA功能。PureCap平台的有用性在于其能够使用高纯度mRNA直接比较细微的帽结构修饰效应，预期将通过未来的机制验证和优化（包括对脱帽介导降解的抗性评估和对免疫应答的影响）促进mRNA治疗设计的发展。