利用肥大细胞和TLR9激动剂的双佐剂黏膜疫苗用于保护免受痘病毒感染

《RSC Pharmaceutics》：Dual-adjuvant mucosal vaccine leveraging mast cell and TLR9 agonists for protection against poxvirus infection

　　

肥大细胞（Mast cells, MC）是主要分布于皮肤下层和黏膜表面的先天性免疫细胞，在宿主对病原体的反应等多种生理过程中发挥作用。近期，肥大细胞激活剂（mast cell activators, MCA）被确认为黏膜疫苗佐剂，能够促进强烈且抗原特异性的免疫应答。研究人员对先前鉴定的小分子MCA ST101036进行了广泛的结构-活性关系（structure–activity relationship, SAR）分析，以进一步优化其佐剂性。由此开发了衍生物VAP-1185，该化合物在体外表现出改善的肥大细胞脱颗粒活性，并在体内诱导偏向Th2的免疫应答。虽然单一佐剂的黏膜疫苗已显示出有效性，但结合两种佐剂可激活多条免疫通路，从而产生更强且更全面的免疫应答。此外，双佐剂疫苗能够引发平衡的Th1/Th2应答，从而产生同等有效的细胞免疫和体液免疫。研究人员将VAP-1185与经FDA批准的佐剂胞嘧啶磷酸鸟嘌呤（cytosine phosphoguanine, CpG）联用，后者可激活Toll样受体9（Toll-like receptor 9, TLR9）并促进偏向Th1的免疫应答。这种双佐剂配方在体外促进炎症细胞因子的产生，在体内产生加性体液效应和活跃的细胞应答，并且在鼻内给予C57BL/6小鼠时具有良好的安全性。随后，该佐剂配方还能够保护BALB/c小鼠免受致命剂量的痘苗病毒攻击。因此，研究人员报道了一种新型黏膜疫苗配方，该配方可产生有效的Th1/Th2平衡免疫应答。

**一、研究背景、问题与目的**

正痘病毒属（Orthopoxvirus）包括天花病毒、猴痘病毒（mpox）、牛痘病毒和痘苗病毒（vaccinia virus）。尽管天花已被全球根除，但由于人群免疫力下降、生物恐怖威胁以及猴痘疫情全球暴发，开发新型正痘病毒疫苗仍十分迫切。目前FDA批准的两款疫苗ACAM2000?（复制型痘苗病毒）和JYNNEOS?（非复制型痘苗病毒）各有局限：前者不能用于免疫缺陷人群（如婴幼儿、孕妇、癌症患者），后者诱导的中和抗体在接种后6–12个月迅速下降。此外，这两种疫苗均需注射给药，存在疼痛、产生医疗锐器废弃物、无法诱导黏膜IgA抗体等缺点。鼻内（intranasal, I.N.）黏膜疫苗可克服上述问题，但其开发受限于安全有效的黏膜佐剂缺乏。

肥大细胞激活剂（mast cell activators, MCA）是一类新型黏膜疫苗佐剂，具有良好安全性，但通常诱导偏向Th2的免疫应答。为了同时激活Th1通路，研究人员将MCA与经FDA批准的Toll样受体9（Toll-like receptor 9, TLR9）激动剂胞嘧啶磷酸鸟嘌呤（cytosine phosphoguanine, CpG）联用，旨在实现Th1/Th2平衡的全面免疫应答。本研究基于先导小分子MCA ST101036进行结构-活性关系（SAR）优化，获得衍生物VAP-1185，然后将其与CpG组合，开发针对正痘病毒的双佐剂黏膜疫苗，并评估其免疫原性、保护效力及安全性。论文发表在《RSC Pharmaceutics》。

**二、关键技术方法**

1. **结构-活性关系（SAR）分析**：对ST101036的嘧啶核心进行位点定向修饰（R1、R2位及三氟甲基CF₃），合成35个衍生物，通过MC/9细胞（小鼠肥大细胞系）脱颗粒实验筛选出先导化合物VAP-1185。
2. **体外免疫细胞活化**：使用C57BL/6小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDCs）检测VAP-1185、CpG及其组合的细胞毒性（LDH法）和炎症细胞因子（TNF-α、IL-6）产生（ELISA）。
3. **体内免疫实验**：以卵清蛋白（OVA）或痘苗病毒B5R蛋白为抗原，经鼻内免疫C57BL/6或BALB/c小鼠（每组10只，来自Jackson Laboratory），检测血清（IgG, IgG1, IgG2c/IgG2a）和黏膜（鼻腔灌洗液IgA）抗体（ELISA）以及脾细胞细胞因子（IFN-γ、IL-2）产生的ELISpot。
4. **病毒攻击模型**：BALB/c小鼠免疫后第56天，经鼻内滴注5×10⁴ PFU痘苗病毒Western Reserve株，监测14天体质量与临床评分，用Kaplan-Meier法分析生存率。
5. **安全性评价**：免疫后24小时取鼻腔组织进行组织病理学评价（H&E染色，由认证兽医病理学家评分），并检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）作为肝损伤标志物。

**三、研究结果**

**VAP-1185被鉴定为ST101036的强效类似物**
通过SAR分析，在35个衍生物中筛选出VAP-1185。与母体化合物ST101036相比，VAP-1185在小鼠MC/9细胞中表现出显著增强的脱颗粒活性。该活性依赖于嘧啶核心C2位的2-甲基氨基哌嗪取代和C4'位烷基修饰，且CF₃基团对活性至关重要。跨上皮电阻（TEER）实验显示VAP-1185不破坏鼻上皮细胞紧密连接，表明其佐剂活性不依赖屏障破坏机制。

**VAP-1185联合CpG在体外诱导炎症细胞因子应答**
单独应用VAP-1185（1 μg）对BMDC有显著细胞毒性，但联合CpG后毒性消失。VAP-1185单独几乎不诱导IL-6或TNF-α，CpG单独显著上调两种细胞因子；联合组产生中等水平的IL-6和TNF-α，但总体低于CpG单独组，说明VAP-1185可部分抑制CpG的促炎作用。

**VAP-1185联合CpG在体内产生加性体液效应**
在C57BL/6小鼠（OVA模型）中，联合组在第56天产生显著高于任一单独佐剂组的OVA特异性总IgG（p<0.001），且IgG1（Th2相关）和IgG2c（Th1相关）均显著提升。联合组鼻腔灌洗液IgA水平也显著高于单独组。脾细胞ELISpot显示，联合组经SIINFEKL肽（OVA MHC-I表位）刺激后产生的IL-2显著高于CpG组和VAP-1185组，表明更强的CD8⁺ T细胞应答。

**VAP-1185联合CpG在致命攻击模型中提供保护**
在BALB/c小鼠（B5R抗原模型）中，CpG组与联合组诱导的B5R特异性IgG和IgG1相当，均显著高于VAP-1185组。IgG2a方面，联合组与阳性对照AddaVax组相当，但低于CpG组。病毒攻击后，PBS组和VAP-1185组全部死亡（保护率0%和11.1%）；CpG组和AddaVax组100%存活；联合组存活率为90%（与CpG及AddaVax无统计学差异）。联合组体质量变化与AddaVax组相似，但CpG组体质量保持最佳。所有组血清中和抗体水平均很低，说明保护可能依赖其他机制。

**VAP-1185联合CpG表现出良好的安全性**
组织病理学分析显示，含VAP-1185的组别（单独或联合）在鼻腔出现轻度急性鼻炎（中性粒细胞和巨噬细胞浸润），但无上皮损伤；CpG组与PBS组相似。部分含VAP-1185组别的嗅上皮出现零星细胞凋亡/坏死，意义尚不明确。血清ALT水平在所有免疫组中与PBS组无显著差异，提示未引起急性肝损伤。

**四、总结讨论与结论**

研究人员通过SAR分析开发了优化的小分子MCA VAP-1185，其与CpG联合构成双佐剂黏膜疫苗配方。该配方在体内诱导加性抗原特异性体液免疫（IgG、IgA）和细胞免疫（CD8⁺ T细胞应答），并在痘苗病毒致命攻击模型中提供90%的保护效力，同时表现出良好的局部和全身安全性（仅轻微鼻炎，ALT正常）。研究证实VAP-1185是偏向Th2的佐剂，而CpG偏向Th1，两者联用实现了Th1/Th2平衡的免疫应答。该双佐剂黏膜疫苗平台有望应用于其他感染性疾病的预防。研究结论如下：综上所述，经过广泛SAR分析，研究人员开发了一种小分子MCA，可在体外有效诱导MC脱颗粒。当与FDA批准的佐剂CpG联合时，这两种分子能产生加性抗原特异性体液免疫应答，同时并发产生与偏向Th1的CpG相当的细胞应答。当与痘苗病毒蛋白抗原B5R联用时，该双佐剂配方在致命痘苗病毒攻击中诱导90%的保护。最后，该双佐剂配方表现出有利的安全性特征，ALT浓度不变，仅有轻微急性鼻炎。因此，研究人员开发了一种有效的Th1/Th2平衡的双佐剂黏膜疫苗配方，未来可用于评估其他感染性疾病。