《Journal of Dairy Science》：Effects of Lactiplantibacillus plantarum 16 fermentation on antioxidant capacity and bitterness of enzymatically hydrolyzed skim milk
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乳酸菌发酵可增强食品的益生特性并改善其苦味。本研究探讨了植物乳植杆菌（*Lactiplantibacillus plantarum*）16发酵增强酶解脱脂乳（enzymatically hydrolyzed skim milk, ESM）抗氧化能力同时改善其苦
乳酸菌发酵可增强食品的益生特性并改善其苦味。本研究探讨了植物乳植杆菌（*Lactiplantibacillus plantarum*）16发酵增强酶解脱脂乳（enzymatically hydrolyzed skim milk, ESM）抗氧化能力同时改善其苦味的可能机制。结果表明，*L. plantarum* 16发酵显著提高了ESM中的总肽浓度，并对特定肽丰度产生了显著的调节作用（*P* < 0.05）。其中，47种肽显著上调（*P* < 0.05），包括17种分子量小于1 kDa的低分子量肽；27种肽显著下调（*P* < 0.05），包括疏水性苦味肽LAMAASDISLLDAQSAP和FLIPYMIY（*P* < 0.05）。对这些差异肽对应母蛋白进行KEGG通路注释和功能分析，鉴定出2条关键的抗氧化相关通路，即“过氧化物酶体代谢”和“谷胱甘肽代谢”，且与抗氧化相关的差异蛋白数量超过其他功能相关的蛋白数量。此外，*L. plantarum* 16发酵显著调节了ESM中的代谢物丰度。共鉴定出613种显著差异代谢物，其中295种代谢物显著上调（*P* < 0.05），318种代谢物显著下调（*P* < 0.05）。上调代谢物包括属于醇类、酸类和酮类的风味化合物（如γ-δ-二氧代戊酸和乙偶姻），以及具有潜在抗氧化活性的代谢物，如酪氨酸乳酸酯、苯丙氨酸-酪氨酸和苹果酸。下调代谢物包括与苦味相关的代谢物，如葫芦素D、科罗索苷B和灵芝酸I。这些差异代谢物显著富集于抗氧化通路（如“苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成”和“各种生物碱的生物合成”）以及苦味缓解通路（如“D-氨基酸代谢”）（*P* < 0.01）。*L. plantarum* 16发酵不仅增强了ESM的抗氧化能力，还降低了其苦味。这些发现为开发功能性发酵乳饮料提供了理论基础。
**研究背景与目的**
牛奶作为重要营养源，提供蛋白质、矿物质、维生素等成分，但部分蛋白质易引发过敏反应，限制了乳制品的营养利用。酶解处理通过破坏蛋白质分子内/间化学键，生成低分子量肽或氨基酸，改变蛋白构象和线性表位，从而降低致敏性，同时使营养更易吸收。然而，酶解往往暴露疏水性残基位点，导致苦味物质产生。现有苦味缓解方法（如掩蔽法、美拉德反应）存在水解位点受限、效果不佳及对功能改善不明确等缺点。乳酸菌发酵可增强食品益生特性并改善风味，但单一菌株在提升抗氧化能力的同时对苦味的具体影响及机制尚不明确。研究人员前期研究表明，植物乳植杆菌16（*Lactiplantibacillus plantarum* 16）具有增强酶解脱脂乳（ESM）抗氧化活性的能力。本研究旨在进一步探究*L. plantarum* 16发酵对ESM抗氧化活性和苦味的双重影响，并利用肽组学和代谢组学解析相关机制，为开发益生菌发酵乳饮料提供理论依据。论文发表于《Journal of Dairy Science》。
**主要技术方法**
研究人员从广西巴马长寿人群粪便样本中分离*L. plantarum* 16，使用三种商业蛋白酶（Neutrase、Flavorzyme、Protamex）分别水解12%（wt/wt）脱脂乳溶液（新西兰恒天然脱脂乳粉），通过pH-Stat法监测水解度（DH），结合感官评价（ISO 8586:2023标准，24名健康受试者，视觉模拟标尺法）和电子舌（SA402B系统）筛选最佳蛋白酶。确定Protamex制备ESM后，以5%（vol/vol）接种量将*L. plantarum* 16悬液（1×10
9 cfu/mL）接种至ESM，37°C发酵18 h。采用超滤（3 kDa膜）提取多肽，通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行肽组学分析；采用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱（UHPLC-QExactive HF-X）进行代谢组学分析。肽组学数据经Spectronaut软件定性定量，差异肽筛选标准为倍数变化（FC）>1.2（上调）或FC<0.83（下调），*P*<0.05；代谢组学数据经主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）结合变量投影重要性（VIP）>1和*P*<0.05筛选差异代谢物，FC>1或<1且*P*<0.05定义为显著差异代谢物。KEGG通路注释和富集分析用于功能解析。
**研究结果**
**不同蛋白酶对脱脂乳水解度和苦味的影响**
Protamex组水解度（29.35%）显著高于Neutrase和Flavorzyme组（*P*<0.05）；Protamex组苦味评分（6.2±0.25）显著低于Neutrase组（7.4±0.29）（*P*<0.05），与Flavorzyme组（6.1±0.37）无显著差异。电子舌分析证实Protamex水解物苦味最低、鲜味最高。选择Protamex作为最佳蛋白酶制备ESM。
***L. plantarum* 16发酵对ESM抗氧化活性和苦味的影响**
发酵后ESM（LF-ESM）的DPPH自由基清除率和·OH抑制率均超过64.1%，超氧化物歧化酶（SOD）活性>15.5 U/mL，均显著高于未发酵ESM（*P*<0.05）。LF-ESM苦味评分（4.5±0.38）和电子舌苦味响应值均显著低于ESM（6.3±0.21）（*P*<0.05）。
***L. plantarum* 16发酵对ESM肽的影响**
LF-ESM中<3 kDa的多肽浓度（6.72 mg/mL）显著高于ESM（5.96 mg/mL）（*P*<0.05）。共鉴定74种显著差异肽，47种上调（包括17种<1 kDa的低分子量肽），27种下调（包括疏水苦味肽LAMAASDISLLDAQSAP和FLIPYMIY）。上调肽多为亲水性低分子量肽；下调肽分子量较大（1700–2500 Da），疏水性强。KEGG分析鉴定出2条关键抗氧化通路：“过氧化物酶体代谢”（涉及黄嘌呤脱氢酶/氧化酶相关肽）和“谷胱甘肽代谢”（涉及乳转铁蛋白相关肽）。Gene Ontology（GO）分析显示“抗氧化活性”功能覆盖的差异蛋白数量显著多于其他功能。
***L. plantarum* 16发酵对ESM代谢物的影响**
共鉴定613种显著差异代谢物，295种上调（包括风味化合物如γ-δ-二氧代戊酸、乙偶姻，抗氧化代谢物如酪氨酸乳酸酯、苯丙氨酸-酪氨酸、苹果酸等），318种下调（包括苦味物质葫芦素D、科罗索苷B、灵芝酸I等）。KEGG富集分析显示，“苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成”、“各种生物碱的生物合成”和“D-氨基酸代谢”通路显著富集（*P*<0.001）。D-氨基酸可通过竞争性结合甜味受体抑制苦味信号传导。
**讨论与结论**
讨论部分指出，*L. plantarum* 16发酵可能通过其分泌的酶系统（如胞外蛋白酶、内肽酶、氨肽酶等）进一步水解ESM中残留大分子蛋白质，增加低分子量抗氧化肽含量；同时通过调节黄嘌呤脱氢酶/氧化酶相关肽促进尿酸生成（内源性抗氧化剂），以及通过乳转铁蛋白相关肽促进谷胱甘肽（GSH）合成。代谢层面，菌株通过2-羟基酸脱氢酶、β-葡萄糖苷酶等内源酶调节酚类、有机酸等抗氧化代谢物的丰度，并降低苦味相关代谢物（如葫芦素、强心苷、三萜类化合物）水平。D-氨基酸代谢通路的上调可能通过竞争性抑制苦味受体缓解苦味。此外，发酵导致的pH变化可能影响酶活性和蛋白质构象，进而间接调节抗氧化能力和苦味。
**结论**（翻译原文结论部分）：
*L. plantarum* 16发酵不仅可以通过调控与抗氧化相关的物质（如低分子量肽、生物碱）及功能性通路来增强ESM的抗氧化能力，还可以通过调节与苦味相关的化合物（如疏水性肽、D-氨基酸）及其代谢通路来缓解ESM的苦味。本研究为开发具有抗氧化能力和良好风味的发酵乳饮料及其后生元产品提供了理论基础。
