聚轮烷(polyrotaxane)上N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalactosamine, GalNAc)修饰环糊精的分子流动性实现抗体嵌合体及基因组编辑核糖核蛋白(RNP)的高效肝靶向递送

《Advanced Science》：Molecular Mobility of N-Acetylgalactosamine-Modified Cyclodextrins on a Polyrotaxane for Highly Efficient Liver Targeting of Antibody Chimeras and Genome-Editing Ribonucleoproteins

　　

摘要：三价N-乙酰半乳糖胺(triantennary GalNAc, triGalNAc)因可与去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor, ASGPR)的三聚体结构强相互作用，是成熟的肝靶向平台，但其连接子(linker)设计合成复杂，生产成本高且技术难度大。本研究报道一种替代策略——将单价GalNAc(monoGalNAc)偶联至聚轮烷(polyrotaxane, PRX)的环状分子上，后者可沿轴向高分子链旋转及平移。monoGalNAc修饰聚轮烷(monoGalNAc-PRX)的细胞内摄取效率与triGalNAc修饰聚轮烷相当，且显著高于triGalNAc或monoGalNAc修饰的固定对照聚合物。结果表明，聚轮烷固有的分子流动性使monoGalNAc基团可类三价簇集，从而增强与多个ASGPR寡聚体的多价相互作用。monoGalNAc-PRX成功应用于溶酶体靶向抗体嵌合体(lysosome-targeting antibody chimeras, LYTACs)及基因组编辑纳米颗粒(Cas9 RNP)，证明该技术是传统triGalNAc简便且极具前景的替代品。

论文解读：基于聚轮烷分子流动性的单价GalNAc肝靶向系统及其在LYTAC与CRISPR-Cas9 RNP递送中的应用

研究背景与意义

N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)是去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的特异性配体，广泛用作肝靶向主动靶向配体。传统三价GalNAc(triGalNAc)其三个GalNAc空间排布匹配ASGPR三聚体时可最大化结合亲和力，已被用于siRNA和ASO的小分子核酸药物肝靶向递送并获得上市批准。然而triGalNAc存在明显局限：其一，三价连接子设计合成繁琐，成本高昂且技术门槛高；其二，triGalNAc对大分子（如～190 kDa的Cas9 RNP或全长抗体）的递送增强效果有限，难以满足新兴大分子药物肝靶向需求。已有研究表明，当GalNAc以适当间距排列或与多个ASGPR寡聚体（二聚体至六聚体）作用时也可产生强效摄取，提示不必拘泥于共价固定的三价结构。聚轮烷(PRX)是由线形聚乙二醇(PEG)轴穿过多枚α-环糊精(αCD)并以大位阻端基封端形成的机械互锁超分子聚合物，其环糊精可沿PEG轴旋转与平移，具备独特的分子流动性。研究人员假设，将单价monoGalNAc修饰于PRX的αCD上，借助CD沿轴的动态运动可使monoGalNAc在空间中临时簇集形成类三价排列或与多个ASGPR寡聚体多点结合，从而在简化配体合成的同时实现媲美triGalNAc的肝靶向效果，并进一步拓展至LYTAC与Cas9 RNP的大分子递送。

主要关键技术方法

研究人员以α-环糊精(αCD)/聚乙二醇(PEG, M.W. 20 kDa或35 kDa)构建聚轮烷(PRX)及固定对照葡聚糖(Dextran, DEX)；化学合成GalNAc-spacer-NH₂（短寡乙二醇间隔臂），通过CDI活化将monoGalNAc或triGalNAc偶联至PRX上αCD的羟基或DEX的羟基，制备荧光(FAM)标记及二苯并环辛炔(DBCO)/金刚烷(Adamantane, Ad)端基修饰变体；以无血清及含血清培养的人肝癌细胞系HepG2(ASGPR阳性)和人宫颈癌细胞系HeLa(ASGPR阴性)为细胞模型，通过流式细胞术检测荧光强度评价摄取及竞争性抑制；通过无铜点击化学反应(DBCO-N₃)将monoGalNAc-PRX与Fc区叠氮基修饰的抗牛血清白蛋白(BSA)抗体偶联制备GalNAc-PRX-LYTAC，以FITC-BSA为抗原模型评价体外摄取及小鼠体内肝溶酶体递送；利用氨基化第5代PRX(amino-PRX (5G), β-环糊精端基)与Cas9 RNP形成复合物，再通过主客体相互作用(Ad?βCD)表面功能化monoGalNAc-PRX(Ad端基)，通过动态光散射(DLS)表征粒径与ζ电位，在含/不含胎牛血清(FBS)条件下评估HepG2细胞摄取，经尾静脉单次注射予BALB/c小鼠评估体内生物分布(IVIS成像)及对小鼠转甲状腺素蛋白(TTR)基因的基因组编辑效率(RT-qPCR)。

研究结果

2.1 Synthesis and Cellular Internalization of GalNAc-Modified Polymers（GalNAc修饰聚合物的合成与细胞摄取）

研究人员合成了monoGalNAc-PRX、triGalNAc-PRX及相应的固定对照聚合物monoGalNAc-DEX与triGalNAc-DEX，经¹H NMR与2D-NMR(NOESY)确认聚轮烷机械互锁结构及GalNAc修饰率（monoGalNAc/αCD≈0.9，triGalNAc每3.3个αCD修饰一个）。在HepG2细胞中，monoGalNAc-PRX与triGalNAc-PRX的细胞摄取效率相当，均显著高于monoGalNAc-DEX和triGalNAc-DEX；triGalNAc-DEX摄取高于monoGalNAc-DEX符合传统三价优势，但二者均低于PRX体系。游离GalNAc可竞争性抑制所有GalNAc修饰聚合物的摄取，且在ASGPR阴性的HeLa细胞中均无显著摄取，证实摄取依赖ASGPR介导的内吞。结果表明聚轮烷CD的分子流动性使monoGalNAc能动态调整空间排布、避免空间错配并实现类三价簇集，从而产生与共价triGalNAc相当的多价ASGPR相互作用。

2.2 MonoGalNAc-PRX-Based Lysosome-Targeting Antibody Chimeras (LYTACs)（基于monoGalNAc-PRX的溶酶体靶向抗体嵌合体(LYTAC)）

研究人员制备DBCO末端monoGalNAc-PRX，与Fc区酶法引入叠氮基的抗体通过无铜点击反应偶联得到GalNAc-PRX-LYTAC。体外实验显示GalNAc-PRX-LYTAC可高效将FITC-BSA递送入HepG2细胞，且抗原递送效率显著高于传统triGalNAc-LYTAC，该效应可被游离GalNAc抑制。小鼠尾静脉注射FITC-BSA后给予LYTAC，分离肝细胞溶酶体检测荧光，GalNAc-PRX-LYTAC捕获血液中抗原并递送至肝溶酶体的效率也显著高于triGalNAc-LYTAC，证明monoGalNAc-PRX可作为新型LYTAC肝靶向模块。

2.3 Functionalization of Genome-Editing Nanoparticle With MonoGalNAc-PRX（monoGalNAc-PRX功能化基因组编辑纳米颗粒）

研究人员利用主客体作用将Ad-cap-monoGalNAc-PRX组装于βCD-cap-amino-PRX (5G)/Cas9 RNP复合物表面得到GalNAc-PRX/5G/RNP。DLS显示功能化后粒径减小、ζ电位降低（阳离子表面被屏蔽）。在无血清条件下amino-PRX (5G)/RNP本身摄取较高，但在含10% FBS培养基中其摄取受血清蛋白吸附抑制，而GalNAc-PRX/5G/RNP因表面中性化抗血清干扰且具ASGPR介导内吞，摄取显著优于5G/RNP且不受血清影响，游离GalNAc可抑制该摄取。BALB/c小鼠单次尾静脉注射后，GalNAc-PRX/5G/RNP组肝中靶基因TTR mRNA下调约25%，编辑效率显著高于未功能化5G/RNP组；IVIS活体成像显示荧光标记RNP在肝脏富集明显增强。表明monoGalNAc-PRX功能化可赋予阳离子纳米颗粒肝靶向性与血清稳定性，适用于Cas9 RNP体内基因组编辑递送。

讨论与结论翻译

本研究中，研究人员开发了一种替代且更优的策略——将monoGalNAc修饰于聚轮烷(PRX)的环糊精(CD)上以实现去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)靶向。monoGalNAc-PRX的制备工艺较传统triGalNAc大幅简化。对合成的GalNAc修饰聚合物进行的比较研究表明，聚轮烷上CD固有的分子流动性使修饰的monoGalNAc与ASGPR之间能够实现高效且简便的多价相互作用，这可能是由于CD沿轴的运动调整了修饰GalNAc的空间呈现从而避免空间错配，并使monoGalNAc以类三价方式簇集。此外，monoGalNAc-PRX-LYTAC及monoGalNAc-PRX功能化基因组编辑纳米颗粒是传统triGalNAc靶向递送系统极具前景的替代品。本研究结果为GalNAc配体的开发提供了宝贵见解，有望推动更强效肝靶向药物递送系统的构建。