FOS3D：一个基于荧光的工具包用于表征三维骨肉瘤模型

《Advanced Science》：FOS3D: A Fluorescence-Enabled Toolkit for Characterizing a Three-dimensional Osteosarcoma Model

　　

骨肉瘤（OS）仍是一种罕见的侵袭性原发性骨恶性肿瘤，几十年来治疗进展有限。三维（3D）组织工程模型能够比单层培养更好地再现肿瘤微环境；然而，其常规使用常受限于低通量工作流程和对破坏性分析终点的依赖。在此，研究人员提出FOS3D，一种基于明胶甲基丙烯酰（GelMA）水凝胶的荧光骨肉瘤模型，其中整合了表达稳定绿色荧光蛋白（GFP）的肿瘤细胞。通过改变聚合物浓度和光交联时间，生成了压缩模量约5–50 kPa的水凝胶，覆盖了报道的OS基质环境刚度范围。全孔荧光扫描能够对完整构建体中的增殖进行快速、非破坏性定量，并显示与脱氧核糖核酸（DNA）和代谢测定的相关性。与光片显微镜的集成进一步实现了肿瘤组织的体积成像，揭示了空间分布的时间依赖性变化。转录谱分析和免疫组化（IHC）证实了与细胞外基质（ECM）重塑、干性和耐药通路相关的微环境驱动适应。最后，基于GFP的纵向监测能够对两种OS细胞系中的顺铂（CDDP）和阿霉素（DOX）进行化疗筛选，捕捉剂量依赖性反应和3D培养特有的增强治疗耐受性。总之，FOS3D为在生理相关3D环境中对OS进行高内涵表征和药物反应分析提供了一个可扩展的荧光工具包。

论文解读

**研究背景与问题**

骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是一种罕见但侵袭性强的原发性骨恶性肿瘤，尽管经过数十年研究，其治疗进展十分有限。非转移性OS患者的5年无事件生存率长期徘徊在60%–70%，而转移性病例仅约25%。此外，在当前治疗方案下，高达77%的病例会出现化疗耐药。传统的二维（2D）单层培养无法重现体内三维（3D）微环境的物理和生化约束，而动物模型虽能提供3D和系统性背景，但存在种间差异、伦理问题、成本高昂及实验可控性差等局限。因此，开发能够模拟OS微环境且适合高通量分析的体外3D组织工程模型具有重要意义。然而，3D模型的常规应用面临一个关键瓶颈：在厚构建体中分析复杂化，标准终点测定通常具有破坏性且劳动密集，难以支持纵向研究。因此，亟需一种非破坏性、可重复、可定量的读数方法，能够在多孔板格式下快速获取数据，同时保留样本用于下游成像和分子分析。

**研究内容与结论**

针对上述问题，研究人员开发并验证了FOS3D（Fluorescent Osteosarcoma 3D model）——一种基于明胶甲基丙烯酰（GelMA）水凝胶的机械可调荧光骨肉瘤模型。该模型整合了稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）的OS细胞，利用内源性GFP荧光作为非破坏性增殖读数，结合多孔板荧光扫描和光片显微镜，实现了对3D构建体中肿瘤细胞增殖、空间分布和药物反应的实时、纵向监测。主要结论包括：①通过调节GelMA浓度和光交联时间，可生成覆盖OS基质生理刚度范围（约5–50 kPa）的构建体，且细胞活力在不同刚度下均得以保持；②GFP荧光强度与DNA含量和代谢活性呈强线性相关性，验证了其作为可靠增殖替代指标的适用性；③光片显微镜结合数字重建揭示了细胞在3D构建体中的时间依赖性空间组织变化，包括中心区域聚集和周边区域扩散；④转录谱分析表明，3D培养诱导了与细胞外基质（ECM）重塑（如MMP-13、MMP-3上调）、干细胞性（如NANOG、OCT4、SOX2）及耐药通路（如ABCB1）相关的适应性改变，并通过免疫组化（IHC）检测到P-糖蛋白（ABCB1）表达；⑤化疗药物（CDDP和DOX）筛选显示，3D构建体中药物敏感性显著低于2D，且有效剂量接近临床血浆峰值浓度（C_max），表明该模型能反映微环境介导的药物耐受。该论文发表在《Advanced Science》。

**主要技术方法**

研究人员使用了以下关键方法：①基于GelMA水凝胶的生物制造平台，通过调整聚合物浓度（6%、8%、10% w/v）和405 nm光交联时间（1、2、3分钟）调节构建体压缩模量；②通过慢病毒转导在MG-63和Saos-2 OS细胞系中建立稳定GFP表达（伴随嘌呤霉素筛选），利用CLARIOstar Plus微孔板读取器进行全孔荧光扫描（30×30矩阵，激发/发射470–15/520–20 nm）实现纵向定量；③采用UltraMicroscope Blaze光片显微镜进行全构建体体积成像，结合Imaris 10软件进行表面和斑点的3D重建与球形度分析；④使用RT-qPCR进行基因表达谱分析（包括DNA修复、细胞周期、ECM重塑、干性、缺氧/炎症相关基因），并进行IHC染色检测ABCB1（P-糖蛋白）、Ki-67和波形蛋白。

**研究结果**

**2.1 机械可调GelMA基3D组织工程OS模型的生物制造**
通过改变GelMA浓度和光交联时间，构建体压缩模量范围达6.21±1.6至50.1±8.3 kPa，覆盖OS基质刚度范围。不同刚度条件下，第7天细胞代谢活性无显著差异，但较低GelMA浓度（6%、8%）支持更高的DNA含量。选择6% GelMA交联2分钟作为后续实验条件，因其在机械稳健性和细胞增殖支持间取得最佳平衡。

**2.2 验证GFP作为2D和FOS3D中实时3D增殖评估指标**
在2D（r2=0.9979）和3D（r2=0.9547）中，GFP荧光强度与细胞数量呈强线性正相关。与DNA含量和代谢活性的相关性在2D（r2=0.9957，r2=0.9777）和3D（r2=0.9949，r2=0.9592）中均表现优异。7天纵向监测显示，3D构建体中未处理细胞的GFP荧光增幅（13.4%）显著低于2D（83.1%），且GFP阳性细胞优先在构建体边缘聚集，模拟肿瘤中营养梯度分布。紫杉醇处理可抑制荧光增加。

**2.3 使用光片显微镜可视化和量化FOS3D中的细胞**
不同初始接种细胞数（25k–800k）的构建体经光片成像和Imaris分析显示，GFP斑点数与总细胞数（r2=0.9521）及DAPI斑点数（r=0.945）均有强相关性，证实GFP信号可准确反映3D构建体中的细胞数量。

**2.4 使用光片显微镜纵向可视化FOS3D中细胞分布**
第1天细胞均匀分散；第3天开始形成微簇；第7天荧光密度显著增加，周边区域细胞扩散更明显。球形度分析表明，第7天中心区域细胞更近球形，周边区域更铺展。活/死染色显示构建体中心与表面均保持良好细胞活力。

**2.5 FOS3D的转录与预后特征分析**
RT-qPCR显示，与2D相比，3D培养中p53转录本升高，但下游p21降低，BAX和PUMA变化不大；ECM重塑相关MMP-13和MMP-3上调；干细胞性相关NANOG、OCT4、SOX2及成骨转录因子RUNX-2上调；缺氧相关HIF-1α和VEGFA变化不显著，而炎症因子CXCL8（IL-8）升高；DNA修复和耐药相关基因XRCC3、ERCC1、ABCB1等部分升高。IHC检测到ABCB1（P-糖蛋白）在构建体中广泛表达（经三种抗体克隆验证），Ki-67阳性细胞散布于构建体中，波形蛋白呈广泛胞质阳性。

**2.6 FOS3D中的化疗药物筛选**
针对MG-63-GFP和Saos-2-GFP两种细胞系，利用GFP荧光监测CDDP和DOX的剂量依赖性响应。2D中IC₅₀和IC₉₀值用于定义3D实验中的低剂量和高剂量。在3D构建体中，低剂量（IC₅₀等效）仅产生微弱抑制，而高剂量（IC₉₀等效）则显著降低GFP荧光和代谢活性。与临床血浆C_max比较，高剂量浓度大多处于或接近临床可达到水平，表明3D微环境赋予的额外保护需要更高药物浓度才能抑制肿瘤。

**讨论与结论**

讨论部分指出，FOS3D的主要方法学进展在于将多孔板荧光读数与光片显微镜相结合，减少了对破坏性终点分析的依赖。3D构建体中的转录适应性（如p53/p21失衡、MMP上调、干细胞性激活、ABCB1表达）与药物筛选结果一致，共同反映了微环境介导的药物耐受机制。研究局限性包括仅使用两种OS细胞系、模型简化（未包含骨矿物相、基质细胞、免疫细胞及动态流动等）。结论强调，该研究开发并验证了一种机械可调的基于GelMA的荧光3D OS模型（FOS3D），实现了利用内源性GFP荧光对肿瘤增殖进行实时3D监测。GFP监测与光片显微镜结合揭示了时空组织模式，化疗筛选捕捉了3D微环境驱动的药物耐受。RT-qPCR和IHC确认了3D培养诱导的转录适应及ABCB1/P-糖蛋白表达。总体而言，FOS3D提供了一个可扩展的策略，用于在生理相关3D条件下定量OS生长和治疗反应，同时保留样本用于下游分析，有望加速OS模型的迭代优化并提高临床前药物筛选的通量和转化性。