以Fangchinoline为靶点调控DNGR-1增强树突状细胞抗原交叉呈递介导的抗黑色素瘤免疫

《Advanced Science》：Targeting DNGR-1 with Fangchinoline Elevates Dendritic Cell Antigen Cross-Presentation-Mediated Antitumor Immunity in Melanoma

　　

树突状细胞（dendritic cells, DCs）对外源性抗原的交叉呈递（cross-presentation）是启动CD8⁺ T细胞介导的抗肿瘤免疫的关键环节。DNGR-1（CLEC9A）是表达于常规1型树突状细胞（conventional type 1 DCs, cDC1s）表面的C型凝集素受体（C-type lectin receptor），可促进死亡细胞相关抗原的摄取及其向胞质内的递送。然而，目前尚未见靶向DNGR-1的小分子调节剂被报道。本研究中，研究人员鉴定出天然双苄基异喹啉生物碱——防己碱（fangchinoline）作为一种能够以DNGR-1依赖性方式增强抗原交叉呈递的小分子调节剂。功能性筛选显示，防己碱可促进主要组织相容性复合体I类（major histocompatibility complex class I, MHC-I）限制性交叉呈递及CD8⁺ T细胞 priming。表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）、热稳定性迁移、探针标记及定点突变实验证实，防己碱结合于DNGR-1的由Trp₂₀₉、Glu₂₂₅、Arg₂₂₆构成的口袋结构。DNGR-1的激活可启动Syk（spleen tyrosine kinase）-Nox2（NADPH oxidase 2）信号通路，增加吞噬体活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成及膜通透性，从而促进抗原进入胞质。防己碱具有亚群依赖性效应：在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF）/白细胞介素-4（interleukin-4, IL-4）来源的树突状细胞及体内内源性cDC1相关环境中，其增强交叉呈递相关功能；而在Flt3L（Fms-related tyrosine kinase 3 ligand）诱导的、DNGR-1高基线表达的树突状细胞中，则促进DNGR-1依赖性细胞死亡。在黑色素瘤模型中，防己碱与树突状细胞过继转移及PD-1（programmed cell death protein 1）阻断联合应用，可促进CD8⁺ T细胞介导的肿瘤控制。此外，防己碱在人树突状细胞-T细胞共培养体系中可增强抗原特异性CD8⁺ T细胞激活。综上所述，本研究确立了防己碱作为靶向DNGR-1的调节剂，可实现抗肿瘤免疫的情境依赖性增强。

黑色素瘤是一种起源于黑色素细胞的侵袭性恶性肿瘤，是全球致死率最高的皮肤癌类型之一。尽管早期黑色素瘤可通过手术和化疗进行管理，但晚期或转移性患者的治疗选择有限且预后较差。虽然以PD-1、PD-L1及CTLA-4（cytotoxic T lymphocyte–associated protein 4）为靶点的免疫检查点抑制剂已显著改变了黑色素瘤的治疗格局，但仅部分患者能获得持久缓解，原发性及获得性耐药仍是重大临床挑战。因此，亟需开发新型免疫调节策略以增强现有免疫疗法的疗效并克服肿瘤诱导的免疫抑制。

树突状细胞作为抗肿瘤免疫的核心调控者，其独特之处在于能够通过MHC-I分子交叉呈递外源性抗原，从而启动细胞毒性CD8⁺ T淋巴细胞。这一称为抗原交叉呈递的过程是产生有效T细胞介导免疫的关键，也是树突状细胞癌症疫苗的力学基础。然而，调控交叉呈递的分子通路尚未完全阐明，且鲜有能特异性增强树突状细胞该功能的药物被鉴定。靶向调节树突状细胞交叉呈递能力代表着增强抗肿瘤免疫反应的有前景方向，无论用于疫苗开发还是与检查点阻断疗法联合应用。

DNGR-1（又称CLEC9A）是选择性表达于cDC1s上的死亡细胞感应受体，cDC1s是专门负责CD8⁺ T细胞交叉启动的DC亚群。DNGR-1识别坏死细胞暴露的丝状肌动蛋白（filamentous actin, F-actin），促进细胞相关抗原的摄取和呈递，在启动抗肿瘤免疫中发挥不可替代的作用。该功能受到转录因子IRF8（interferon regulatory factor 8）的严格调控，IRF8主导cDC1谱系定向。尽管DNGR-1在遗传模型中已被广泛研究，但迄今尚无能够直接靶向并激活该受体的小分子调节剂报道，这构成了治疗手段中的关键空白。

天然产物是免疫调节剂丰富且尚未充分开发的来源，具有独特的结构和功能特性。研究人员采用基于细胞的抗原呈递检测方法对天然产物文库进行功能性筛选，鉴定出源自 Stephania tetrandra 的双苄基异喹啉生物碱防己碱是树突状细胞抗原交叉呈递的强效增强剂。虽然防己碱此前已被报道具有抗增殖和抗炎特性，但其免疫学作用机制 largely unknown。研究人员证实防己碱结合DNGR-1的功能性口袋，增强Syk-Nox2-ROS轴下游信号传导。该激活促进吞噬体膜通透化，推动内化抗原向胞质的转运，这是通过胞质途径进行交叉呈递的关键步骤。值得注意的是，防己碱选择性增强交叉呈递，但不诱导树突状细胞成熟或促炎细胞因子释放，这与传统免疫佐剂形成区别。该研究进一步揭示了防己碱在GM-CSF/IL-4来源树突状细胞中诱导选择性交叉呈递相关特征，并与树突状细胞免疫治疗及PD-1阻断在小鼠黑色素瘤模型中发挥协同作用。

该研究主要关键技术方法包括：基于MutuDC细胞系和OVA模型的天然产物文库功能性筛选体系；表面等离子体共振分析、细胞热稳定性迁移实验、点击化学探针标记及竞争性抑制实验用于验证防己碱与DNGR-1的直接结合；分子对接模拟结合定点突变分析鉴定防己碱结合的DNGR-1功能口袋；采用shRNA knockdown、CRISPR-Cas9介导的CleC9a敲除及中和抗体阻断进行DNGR-1遗传学和功能学干预；利用OxyBURST探针流式检测、皂苷-嘌呤霉素逃逸实验、mCherry-lysenin荧光报告系统及细胞色素c-磁珠法评估吞噬体ROS产生及膜通透性变化；构建B16和B16-OVA皮下移植瘤模型的体内治疗研究，包括预防性和治疗性模型；CD11c-tdTomato-DTR小鼠进行树突状细胞条件性耗竭及过继转移实验；以及人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）来源树突状细胞与CD8⁺ T细胞共培养体系评估人源细胞功能活性（样本来源于中山市中医院招募的健康成年男性供体，经中国临床试验注册中心批准）。

**2.1 天然产物功能性筛选鉴定防己碱为抗原交叉呈递和CD8⁺ T细胞priming的强效增强剂**

研究人员首先观察到B16黑色素瘤细胞条件培养基可显著降低MutuDCs的抗原交叉呈递能力。为鉴定能够恢复或增强树突状细胞交叉呈递的小分子，研究人员建立了以OVA为模型抗原的体外筛选系统，对约1500种化合物的天然产物文库进行筛选。防己碱脱颖而出，显著增强H-2K^b-SIINFEKL表面表达。验证实验证实，防己碱可增强MutuDCs和原代骨髓来源树突状细胞（包括GM-CSF/IL-4分化的G-BMDCs和Flt3L诱导的F-BMDCs）中全长OVA的交叉呈递，但在无OVA时不影响H-2K^b-SIINFEKL水平。磁珠摄取实验表明防己碱不改变MutuDCs的吞噬能力，且不影响直接肽段呈递，提示其作用特异性针对抗原处理和交叉呈递通路。值得注意的是，防己碱不影响基础MHC-I表达，也不诱导MHC-II、CD80、CD86上调或IL-12/23p40分泌，表明其增强交叉呈递而不诱导经典成熟或炎症激活。

功能后果评估显示，防己碱处理的MutuDCs可增强OT-I CD8⁺ T细胞IFN-γ分泌，并增强T细胞对B16-OVA靶细胞的杀伤活性。在B16-OVA肿瘤模型中，每日腹腔注射防己碱（10 mg/kg）可增加肿瘤引流淋巴结中H-2K^b-SIINFEKL⁺ cDC1s比例，但不改变cDC1s总数，证实其在体内增强树突状细胞抗原交叉呈递能力。

**2.2 防己碱通过CD8⁺ T细胞应答激活黑色素瘤模型中的树突状细胞介导抗肿瘤免疫**

在B16治疗模型中，单独防己碱或G-BMDCs均不能显著抑制肿瘤生长，但联合应用可产生显著肿瘤抑制效果。F-BMDCs与防己碱联合仅产生有限治疗获益。预防性模型中，B16细胞与G-BMDCs共接种后给予防己碱，显著延迟肿瘤发生并降低肿瘤负荷。在B16-OE-Flt3L肿瘤模型中，Flt3L过表达本身可部分减缓肿瘤生长，但额外给予防己碱未能进一步改善肿瘤控制，提示高内源性Flt3L环境中协同获益有限。

肿瘤免疫微环境分析显示，联合治疗显著增加CD8⁺ T细胞浸润，免疫荧光染色证实CD8α⁺ T细胞与IFN-γ和颗粒酶B（granzyme B, GZMB）的共定位增强。抗CD8α抗体体内耗竭完全消除了防己碱+G-BMDC治疗的肿瘤抑制效果和生存获益，证实CD8⁺ T细胞是该治疗策略中不可或缺的主要效应群体。

**2.3 DNGR-1是防己碱增强树突状细胞交叉呈递和CD8⁺ T细胞priming的必需分子**

PCR array筛选发现fangchinoline处理的MutuDCs中Clec9a显著上调。shRNA介导的Clec9a knockdown和中和抗体阻断均显著损害防己碱诱导的抗原交叉呈递增强。使用死亡B16-OVA细胞作为细胞相关抗原源时，防己碱增强交叉呈递的效应较可溶性OVA更为显著，且该增强效应在DNGR-1/CLEC9A干扰后显著减弱。OT-I T细胞功能实验表明，DNGR-1阻断显著减少IFN-γ分泌、抑制T细胞增殖并减弱肿瘤细胞杀伤。野生型和Clec9a敲除BMDCs的比较证实，DNGR-1缺失 abolished 防己碱诱导的交叉呈递增强。

**2.4 DNGR-1是防己碱增强树突状细胞抗肿瘤活性在体作用的必需分子**

体内实验中，DNGR-1中和抗体阻断显著削弱防己碱+G-BMDC联合治疗的肿瘤生长抑制效果。在CD11c-tdTomato-DTR树突状细胞条件性耗竭模型中，过继转移野生型G-BMDCs可与防己碱协同抑制肿瘤生长，而Clec9a缺陷G-BMDCs该效应显著减弱，确认DNGR-1在树突状细胞内的细胞自主性需求。然而，野生型或Clec9a敲除F-BMDCs均未能与防己碱产生显著肿瘤控制，提示防己碱增强的树突状细胞治疗效应并非单纯由DNGR-1表达量决定，而与不同树突状细胞亚群的独特转录或功能程序有关。

**2.5 防己碱在G-BMDCs中增强DNGR-1表达，但在DNGR-1高表达的F-BMDCs中诱导凋亡**

基线分析显示G-BMDCs DNGR-1表达相对较低，而MutuDCs和F-BMDCs表达较高。防己碱处理G-BMDCs可显著增加CleC9a mRNA和DNGR-1蛋白水平，同时上调XCR1表达及IRF8 mRNA和蛋白水平。DNGR-1阻断可减少IRF8和DNGR-1的上调，提示DNGR-1激活与IRF8表达之间存在正反馈环路。然而，在F-BMDCs中，防己碱长时间处理（36小时）显著增加细胞凋亡，该效应可被DNGR-1阻断逆转，提示DNGR-1高表达使F-BMDCs对防己碱诱导的氧化应激敏感。Flt3L来源树突状细胞的cDC1和cDC2亚群分析显示防己碱不影响其DNGR-1表达。

**2.6 防己碱结合DNGR-1由Trp₂₀₉、Glu₂₂₅和Arg₂₂₆构成的功能口袋以增强树突状细胞抗原交叉呈递**

SPR分析证实防己碱与纯化小鼠DNGR-1直接结合，解离常数K_D为1.833 μM。细胞热稳定性迁移实验显示防己碱增强DNGR-1热稳定性。可点击化学防己碱探针（Fan-probe）的pull-down实验证实其与DNGR-1的特异性结合，且过量游离防己碱可竞争性抑制。流式细胞术和共聚焦显微镜确认探针在MutuDCs膜表面的定位，DNGR-1 knockdown显著减少探针结合。

分子对接模拟利用DNGR-1晶体结构（PDB: 3J82）预测最能量有利的结合构象（-9.25 kcal/mol），揭示由Trp₂₀₉、Glu₂₂₅、Arg₂₂₆构成的口袋，防己碱在此形成2.2-2.6 ?的多重氢键。定点突变验证Trp₂₀₉→Phe（W209F）、Glu₂₂₅→Gln（E225Q）、Arg₂₂₆→Ala（R226A）显著损害防己碱诱导的交叉呈递增强；而Tyr₂₅₂、Arg₁₅₄、Lys<sub>258突变影响较小。Fan-probe结合在W209F和R226A突变细胞中显著降低。

**2.7 防己碱通过DNGR-1-Syk-Nox2-ROS介导的吞噬体通透化促进抗原交叉呈递**

免疫印迹显示防己碱浓度依赖性增加Syk在Tyr348和Tyr352位点的磷酸化，DNGR-1阻断显著减少该激活。OxyBURST标记微球流式检测显示防己碱时间依赖性增加G-BMDCs吞噬体ROS产生。皂苷-嘌呤霉素实验证实防己碱增加MutuDCs内体-胞质逃逸，该效应被DNGR-1阻断逆转。mCherry-lysenin荧光报告系统显示防己碱增加吞噬体膜通透性。细胞色素c-磁珠功能实验证实防己碱增强吞噬体膜通透性导致的细胞凋亡。

Syk抑制剂R406 abolished 防己碱诱导的吞噬体ROS增加，逆转Galectin-3募集和抗原交叉呈递增强。Nox2抑制剂DPI同样阻断交叉呈递增强。α-生育酚（α-tocopherol）清除吞噬体ROS可抑制细胞色素c诱导的凋亡和抗原交叉呈递增强。这些结果共同支持防己碱通过DNGR-1-Syk-Nox2-ROS通路就好增强吞噬体膜通透化，促进抗原胞质转运，从而增强交叉呈递。

**2.8 防己碱增强PD-1阻断疗效并促进人树突状细胞介导的CD8⁺ T细胞应答**

B16黑色素瘤治疗模型中，防己碱、G-BMDCs和抗PD-1联合应用较单药治疗显著抑制肿瘤进展。单细胞RNA-seq分析显示Clec9a在黑色素瘤微环境树突状细胞中选择性表达。TIMER数据库分析揭示树突状细胞丰度和CLEC9A表达与黑色素瘤患者总生存期正相关。人PBMC来源树突状细胞与CD8⁺ T细胞共培养实验中，防己碱剂量依赖性增强CD8⁺ T细胞增殖，且无肿瘤抗原加载时T细胞增殖 minimal，证实防己碱诱导的T细胞增殖具有抗原特异性。

**讨论**

树突状细胞疫苗是癌症免疫治疗中极具前景的策略。该研究确立防己碱为首个报道的DNGR-1功能性小分子调节剂。防己碱选择性增强抗原交叉呈递而不诱导经典成熟或炎症激活，其作用机制涉及DNGR-1-Syk-Nox2-ROS轴促进吞噬体膜通透化和抗原胞质转运。研究揭示了树突状细胞亚群情境依赖性响应：低DNGR-1基线的G-BMDCs表现为IRF8相关DNGR-1上调和交叉呈递功能增强，而高DNGR-1基线的F-BMDCs在长时间暴露后发生凋亡。该发现对树突状细胞疫苗设计和患者分层具有重要启示。

**研究结论**

该研究鉴定防己碱为新型DNGR-1小分子调节剂，其通过结合DNGR-1功能性口袋增强抗原交叉呈递，诱导树突状细胞选择性交叉呈递相关特征，并增强抗肿瘤免疫。机制上，DNGR-1-Syk-Nox2-ROS轴参与促进吞噬体膜通透化，使抗原转入胞质——这是通过胞质途径进行交叉呈递的关键步骤，进而促进CD8⁺ T细胞priming。防己碱通过促进树突状细胞交叉呈递和CD8⁺ T细胞激活（包括人离体共培养系统中），作为靶向DNGR-1的免疫调节候选药物值得进一步评估，尤其适用于与检查点阻断或树突状细胞策略联合应用的黑色素瘤治疗。</sub>