HMGN1和VP64融合蛋白协同增强高精度且PAM灵活的碱基编辑

《Advanced Science》：Synergistic HMGN1 and VP64 Fusions Potentiate High-Precision and PAM-Flexible Base Editing

　　

RNA引导的CRISPR衍生碱基编辑器（Base Editors，BEs）通过实现靶向碱基替换，彻底改变了基因组编辑领域。然而，其应用常受限于PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列的严格要求以及较低的编辑精确度（旁观者编辑）。本研究中，研究人员提出了一种稳健策略，通过将近PAM-less的Cas9变体SpRY与截短的CDA1（Cytidine Deaminase 1，胞苷脱氨酶1）胞苷脱氨酶偶联来克服上述限制。尽管该组合最初表现出亚 optimal的效率，但研究人员系统筛选了多种候选DNA结合蛋白，发现HMGN1（High Mobility Group Nucleosome Binding Domain Containing Protein 1，高迁移率族核小体结合域蛋白1）和VP64（Viral Protein 64，病毒蛋白64）的协同融合能够显著增强编辑活性，且不损害精确性。重要的是，这种增强的编辑效率并未显著增加脱靶效应。研究人员构建的新型BEs不仅在酵母中表现稳健，在水稻中也展现了良好性能，表明其在基因治疗、精准育种和基础研究中的广泛应用前景。

## 研究背景与问题提出

CRISPR-Cas系统作为细菌适应性免疫系统，可保护宿主抵御病毒和质粒等入侵核酸。其中，酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）来源的SpCas9是广泛应用于多种生物的基因组编辑工具。传统CRISPR-Cas工具在产生DNA双链断裂（Double-Strand Breaks，DSBs）后，主要依赖易错的非同源末端连接（Non-Homologous End Joining，NHEJ）修复，导致随机插入或缺失（indels），适用于基因敲除，但难以满足需要引入点突变的基因治疗与精准育种需求。

碱基编辑器（BEs）通过将催化缺陷型Cas核酸酶与脱氨酶融合，可在不产生DSB且无需供体DNA模板的条件下实现特定碱基转换，包括C-to-T、A-to-G以及效率较低的C-to-G或A-to-Y（Y=C或T）等点突变。然而，当前BEs存在两大核心局限：其一，**编辑精确度低**，即存在广泛的活性窗口（约4-17个核苷酸），导致旁观者编辑（bystander editing）——当目标位点附近存在多个胞嘧啶时，非目标C也会被编辑，这在纠正人类遗传疾病时构成严重风险；其二，**PAM序列限制严格**，传统SpCas9识别NGG PAM，限制了可靶向的基因组位点范围。尽管先导编辑（Prime Editing，PE）可实现所有12种单碱基替换和小片段插入缺失，但其效率通常低于BEs，且设计复杂、分子量大，不利于病毒载体递送。

研究人员此前已通过将nCas9（切口酶）与海七鳃鳗来源的AID同源物CDA1的截短变体融合，建立了主要编辑PAM上游第18位胞嘧啶（C_-18）的高精度CBEs（Cytidine Base Editors，胞嘧啶碱基编辑器）。然而，这类编辑器仍依赖含G的PAM序列。因此，**开发不受PAM限制、兼具高精度和高效率的碱基编辑平台**成为本研究的核心目标。

## 关键技术方法

本研究在**酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）**和 ARC 中开展碱基编辑实验，酵母使用二倍体菌株BY4743，通过半乳糖诱导BE表达，采用高通量测序（Illumina NovaSeq 6000）定量分析编辑效率与精确度，全基因组测序评估脱靶效应，RNA-seq分析转录组脱靶；在水稻（Oryza sativa L. ssp. japonica）中通过农杆菌介导转化成熟胚愈伤组织，20个内源位点验证编辑效率。研究人员系统筛选了15种DNA结合蛋白（含转录激活因子、染色质相关因子、先驱转录因子、DNA弯曲蛋白四类），通过N端融合策略优化编辑器架构。

## 研究结果

**2.1 扩展高精度CBEs的碱基编辑范围至近PAM-less位点**

研究人员将nSpRY（近PAM-less Cas9变体，识别NRN和NYN作为PAM，R=A或G，Y=C或T）与全长或C端截短的CDA1融合，构建七种BEs。在12个非NGG靶位点评估发现：全长CDA1-SpRY-BE3在C_-14至C_-19宽窗口内编辑，而截短CDA1变体（尤其是CDA1Δ194-SpRY-BE3）保持1-2 nt的窄活性窗口，最大编辑效率位于C_-18，且C_-18编辑效率是次优位点的2-3倍。定量分析86个位点证实，CDA1Δ194截短消除远端旁观者活性（C_-6）和边界扩展（C_-19），为最佳架构。值得注意的是，截短变体在NHN PAM位点的效率较全长提升最高达6.11倍，机制验证发现截短限制了sgRNA间隔区的自体编辑（self-editing），减少多重错配sgRNA积累，保护靶向复合体功能。SpRY在NRN PAM效率（29.17%）高于NYN（16.56%）。与Cas9-NG、SpG比较，三者精度相当，但SpRY在部分NG位点效率较低。全基因组测序显示截短CDA1的SpRY BEs脱靶单核苷酸变异（Single-Nucleotide Variants，SNVs）少于全长融合，CDA1Δ190-SpRY-BE3的转换水平接近阴性对照。

**2.2 基因组中任意用户选定单胞嘧啶的精准编辑**

基于SpRY-BEs在C_-18的选择性编辑能力，研究人员建立四步设计流程：（i）获取基因组序列并识别目标C；（ii）将目标C定位至C_-18以确定20-bp间隔区和PAM，设计sgRNA；（iii）依PAM序列选择BE：NGG用nCas9-CDA1Δ，NGH用Cas9-NG/SpG-CDA1Δ，其他PAM用SpRY-CDA1Δ；（iv）选择最优截短CDA1版本执行编辑。在含三个连续胞嘧啶的酵母基因组位点验证中，CDA1Δ194-SpRY-BE3相比对照效率提升1.05-7.41倍，单目标C编辑产物占41.60%-63.65%，而对照仅<8.7%。另外四个随机位点验证了一致的高精确度。通过刀豆氨酸（canavanine）选择的单克隆分析中，截短BEs获得11-20个纯合单C编辑克隆（每24个随机挑选），而全长对照仅1-3个。

**2.3 提升高精度SpRY BEs的碱基编辑效率**

为解决SpRY变体效率尤其NYN PAM偏低的问题，研究人员系统筛选15种DNA相互作用蛋白。在N端融合测试中，大多数蛋白降低效率，但HMGN1和VP64单独融合有提升。进而构建VP64-HMGN1和HMGN1-VP64双因子融合，后者效率提升更显著。在16个内源位点验证中，单因子融合仅少数位点有 modest 改善，而HMGN1-VP64组合在所有位点均显著增强效率。扩展至36个位点，HMGN1和VP64单因子平均提升1.17倍和1.42倍，双因子融合平均提升4.24倍。在双sgRNA多重编辑系统中，融合蛋白BEs在目标1和目标2的C_-18效率分别提升6.86倍和2.31倍，单C编辑产物纯度达40.61%和26.12%，对照仅3.2%和7.98%。该融合策略应用于rAPOBEC1介导的SpRY BE，11个位点平均提升2.47倍，证实可扩展至其他常用胞苷脱氨酶。

**2.4 全基因组脱靶编辑分析**

全基因组测序表明，所有截短CDA1的SpRY BEs SNVs少于全长融合；VP64融合导致SNVs轻微增加，可能与VP64改变局部转录活性暴露单链DNA有关，但总体仍显著低于未截短的CDA1-SpRY-BE3。Cas-OFFinder预测的脱靶位点靶向测序显示，新编辑器脱靶频率与对照相当。RNA脱靶分析显示，全长CDA1 BEs的C-to-U脱靶RNA编辑显著增加，而截短BEs包括HMGN1-CDA1Δ194-SpRY-BE3的RNA编辑水平与对照相当，VP64融合仅轻微增加。证实融合策略不显著增强脱靶编辑，保持高特异性。

**2.5 截短CDA1变体和DNA结合蛋白融合在植物细胞中增强碱基编辑**

在水稻细胞中，CDA1Δ194-SpRY-BE4和融合HMGN1-VP64的版本（Fusion-CDA1Δ194-SpRY-BE4）与全长CDA1-SpRY-BE4比较。截短BEs在18/20位点效率提升1.32-4617.95倍，最高达61.09%；融合蛋白进一步将效率提升1.64-5938.93倍（相对全长），最高78.57%，相对截短本身提升1.18-26.87倍。与植物优化的先导编辑器ePPE在七个非NGG位点头对头比较，Fusion-CDA1Δ194-SpRY-BE4在六/七位点效率更高（2.27-28.61倍），平均效率18.53% vs ePPE的5.31%。NRN位点效率仍高于NYN位点。

## 讨论与结论总结

研究人员在本研究中取得了四方面核心进展：大幅扩展高精度BEs至近PAM-less靶点；建立并验证PAM非依赖的四步精准编辑流程；发现HMGN1与VP64协同融合显著增强效率且不损害精度；在酵母和水稻中验证该策略的稳健性。

关于SpRY自体编辑问题，研究人员提出新解释：截短CDA1通过物理限制脱氨酶构象自由度，聚焦C_-18编辑，减少sgRNA间隔区多重C-to-T突变，保护功能性sgRNA池，这与nCas9或其他变体融合截短CDA1时未观察到的现象不同，为缓解SpRY自体编辑提供新策略。四步流程建议优先使用野生型Cas9衍生的BEs，仅在必要时采用变体，以平衡PAM兼容性和编辑效率。

HMGN1-VP64的协同增效机制方面，DNA结合域的融合通过促进脱氨酶与DNA底物相互作用提升效率，但不同脱氨酶（如CDA1与rAPOBEC1）的增效程度存在差异，提示需针对特定脱氨酶优化构象。尽管NYN位点效率仍受限，研究人员建议未来整合SpRYc等增强NYN亲和力的工程化策略。

与PE的比较中，研究人员明确提出两类工具互补：PE在编辑多样性和产物纯度上占优，而优化的高精度BEs在C-to-T转换效率和PAM灵活性上更优，尤其适用于植物精准育种中限制性非NGG位点的编辑。

研究结论翻译如下："In this study, we have (i) substantially expanded the applicability of our previously developed high-precision base editors (BEs) to nearly PAM-less targets, (ii) established a streamlined four-step approach for PAM-independent targeting and validated its capability to precisely edit virtually any cytosine, as demonstrated at five randomly selected genomic sites, (iii) identified specific DNA-binding domains, and particularly their optimal combinations, that strongly enhance editing efficiency without compromising precision, and (iv) demonstrated the robust efficacy of this strategy in both yeast and rice, establishing a versatile toolkit for broad biotechnological applications."（本研究中，研究人员（i）大幅拓展了此前开发的高精度碱基编辑器至近PAM-less靶点，（ii）建立了PAM非依赖的简化四步靶向策略，并在五个随机选择的基因组位点验证了其精准编辑几乎任意胞嘧啶的能力，（iii）鉴定了特定DNA结合结构域，特别是其最优组合，可在不损害精确性的条件下显著增强编辑效率，以及（iv）在酵母和水稻中证明了该策略的稳健功效，确立了适用于广泛生物技术应用的通用工具箱。）