CydDC在天然脂质双层中的构象快照：偶联血红素转运与抗生素耐药性

《Advanced Science》：Conformational Snapshots of CydDC in a Native Lipid Bilayer Coupling Heme Transport to Antibiotic Resistance

　　

血红素是众多生物过程中的必需辅因子，包括细菌呼吸。ABC转运蛋白CydDC通过输出血红素促进细胞色素bd末端氧化酶的组装和成熟，并且已被证明与细菌的抗生素耐药性有关。然而，CydDC在类天然脂质双层中的动态构象仍然未解，其耐药机制也尚不明确。本研究确定了纳米盘重构的CydDC在apo态、核苷酸结合态和血红素结合态的高分辨率冷冻电镜（cryo-EM）结构，为其底物刺激的水解机制提供了直接结构证据。体内和体外表征实验确定了CydDC中对底物结合和转运至关重要的关键残基。生物信息学分析进一步表明CydDC在细菌物种中高度保守。对抗生素耐药菌株中cydC/D的转录组分析显示，cydC/D的表达升高与抗生素耐药性增强相关。此外，血红素结合位点的突变改变了细菌对多种抗生素的敏感性，提示CydDC的输出活性也可能直接参与药物耐药。总之，这些发现为CydDC介导的血红素转运和潜在药物外排提供了机制见解，并为靶向呼吸链的抗菌策略开发提供了依据。

### 研究背景与意义

抗生素耐药性（AMR）的全球性蔓延对公共卫生构成严重威胁，亟需新型抗菌药物。细菌呼吸为病原菌存活与致病提供能量，其中细胞色素bd（cytochrome bd）作为呼吸链末端氧化酶，是细菌在胁迫环境下维持活力的关键因子，且仅在细菌中存在，线粒体中无同源物，因此其组装相关蛋白成为干预细菌能量代谢的潜在靶点。ABC转运蛋白CydDC负责输出血红素以促进细胞色素bd成熟，同时参与硫醇代谢、一氧化氮耐受、pH调节及免疫逃逸等多种生理过程，并在维持细菌氧化还原平衡中发挥核心作用。然而，CydDC在类天然膜环境下的完整动态构象尚未明确，其介导血红素转运与细菌抗生素耐药性之间的关联仍不清楚，不同物种间CydDC的进化关系也未系统表征。为此，研究人员开展了本项工作，论文发表在《Advanced Science》。

### 关键技术方法

研究人员采用了以下主要技术方法：1）生物信息学分析：基于913个原核物种的cydC和cydD直系同源基因进行系统发育重建和序列保守性分析（口袋评分、熵值计算）；2）冷冻电镜（cryo-EM）结构解析：将纯化的E. coli CydDC复合物重构入脂质纳米盘（lipid nanodiscs，含E. coli极性脂质）中，分别与ATP、AMP-PNP或血红素孵育，利用Titan Krios显微镜和K2 Summit探测器采集数据，并经RELION和cryoSPARC处理获得apo态、ATP结合态、AMP-PNP结合态及两种血红素结合态（heme-bound I和II）的高分辨率结构；3）ATP酶活性测定：利用ATPase Activity Assay Kit检测不同条件下CydDC的水解活性；4）转录组分析：从GEO数据库获取E. coli耐药菌株数据集（GSE96706），分析12种抗生素耐药菌中cydC/D的表达变化；5）抗生素敏感性测试：利用λ-Red技术敲除MG1655菌株中的cydDC基因，回补野生型或突变体质粒，测量抑菌圈直径；6）生物层干涉法（BLI）测定血红素结合亲和力。

### 研究结果

#### 2.1 CydC/D在物种间具有进化保守性
通过对913个代表原核物种的cydC和cydD直系同源基因进行系统发育和序列保守性分析，研究人员发现两个基因的编码长度高度保守（cydC中位长度574 bp，cydD为588 bp），且系统发育树显示它们在Gammaproteobacteria、Actinomycetes和Methanomicrobia等类群中具有一致的进化轨迹。口袋评分显示平均完整性为0.955±0.038（cydC）和0.944±0.042（cydD），表明结构完整性高。基于保守性图谱，鉴定出多个保守残基作为候选功能位点，用于后续结构及生化验证。

#### 2.2 CydDC在脂质纳米盘中的精确动态重构
研究人员成功捕获了CydDC在脂质纳米盘中的五种cryo-EM结构：apo态（3.71 ?）、ATP结合态（2.82 ?）、AMP-PNP结合态（2.93 ?）、heme-bound I（3.40 ?）和heme-bound II（3.41 ?）。ATP酶活性测定表明脂质纳米盘中的CydDC活性是去垢剂条件下的2.4倍。所有结构均呈现内向开口（IF）构象，但heme-bound I是此前未报道的核苷酸游离血红素结合状态。血红素结合在由CydC的TM2-3和CydD的TM4-6形成的侧腔中，而非中心腔，这与血红素的疏水性一致。

#### 2.3 血红素结合诱导CydDC构象变化
在heme-bound I中，CydD^H312侧链转向侧腔，与CydC^H85共同提供轴向配位；CydC^R81与血红素丙酸基团形成静电作用；CydC^R136上移并与另一丙酸基团相互作用。heme-bound I与heme-bound II的叠加显示CydD的TM4发生剧烈构象变化，控制侧门开闭：heme-bound I中侧门开放，heme-bound II中TM4显著移动并与血红素、TM6及CydD的肘螺旋形成复杂网络，将侧门锁定为稳定闭合构象。从apo到heme-bound I再到heme-bound II，TMD逐步重排，为后续外向开口和底物释放奠定构象基础。

#### 2.4 底物依赖性ATP水解机制
在apo态中，NBDs呈现不对称排列（Walker A与Signature motif间距离不同）。血红素结合后，NBDs逐渐趋于对称。ATP或AMP-PNP结合不能诱导NBD典型二聚化。heme-bound II中NBDs更对称，CydD的C端区域伸入CydC的NBD空间，将其“拉近”。血红素刺激CydDC的ATPase活性，增强水解效率。ATP结合态和heme-bound II结构为底物依赖性ATP水解机制提供了直接结构证据。CydD^R200与CydC^W467的相互作用在heme-bound II中被破坏，释放对TM4的约束，促进NBD重排。

#### 2.5 血红素转运受损影响细菌抗生素耐药性
转录组分析显示，在氨苄西林（AMP）、头孢西丁（FOX）、萘啶酸（NAL）、呋喃妥因（NIT）和四环素（TET）耐药菌株中，cydC和cydD均显著上调。抗生素敏感性测试发现，血红素结合位点突变体（CydC^R81A、CydC^H85A、CydC^T88A、CydC^H132A、CydD^F247A、CydD^H312A等）对NIT、左氧氟沙星（LEV）、美罗培南（MEM）和头孢他啶（CAZ）的敏感性增加。BLI实验表明这些突变体对血红素的亲和力下降（K_D值0.42–0.81 μm，野生型0.23 μm），在1 μm生理浓度下，血红素结合占有率从约81%降至55–70%。

### 讨论与结论

讨论部分指出，CydDC在细菌进化中高度保守，支持其作为广谱抗生素靶点的潜力。通过整合脂质纳米盘结构数据与已有研究，提出了更完整的血红素转运机制模型：apo态侧门开放；初始血红素结合（heme-bound I）引起TMD轻微移位，破坏CydD^R200-CydC^W467相互作用，导致TM4剧烈运动关闭侧门（heme-bound II）；同时NBD从不规则排列变为对称，预备ATP结合与二聚化。CydC^R81和CydC^H85负责初始招募，CydC^R136和CydD^H312稳定结合。ATP结合驱动NBD二聚化、TMD旋转、周质出口开放及血红素释放。研究还发现CydDC在NBD不对称性方面不同于TmrAB等转运体，强调了其独特性。关于抗生素耐药性机制，研究人员推测血红素转运受损可能破坏电子传递链驱动的ATP生产，进而影响细胞壁和DNA合成，导致对靶向这些途径的药物敏感性改变；同时提出CydDC可能直接参与药物外排或具有其他底物（如谷胱甘肽）的运输功能。研究结论部分翻译如下：通过整合生物信息学、结构生物学和生物化学实验，本研究系统阐明了CydDC参与血红素转运的关键残基，并进一步探究了血红素转运受损对细菌抗生素耐药性的影响。研究工作为开发针对耐药细菌的新型治疗策略提供了新证据。