《The Journal of Pathology: Clinical Research》：YAP-activated lymph node fibroblasts contribute to extracellular matrix remodeling associated with extranodal extension of oral squamous cell carcinoma
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间质反应（Desmoplasia）以癌症相关成纤维细胞（CAFs）的过度扩增和异常细胞外基质（ECM）沉积为特征，广泛存在于尤其是侵袭性癌症中。淋巴结转移的结外扩展（ENE）涉及侵袭性肿瘤细胞穿过淋巴结包膜延伸至结周脂肪组织，导致全身性转移。因此，需要明确间质
间质反应（Desmoplasia）以癌症相关成纤维细胞（CAFs）的过度扩增和异常细胞外基质（ECM）沉积为特征，广泛存在于尤其是侵袭性癌症中。淋巴结转移的结外扩展（ENE）涉及侵袭性肿瘤细胞穿过淋巴结包膜延伸至结周脂肪组织，导致全身性转移。因此，需要明确间质反应在ENE形成中的具体作用。本研究旨在探讨间质反应与口腔鳞状细胞癌（OSCC）ENE形成之间的关联，重点关注Yes相关蛋白（YAP）介导的成纤维细胞活化和ECM重塑。研究人员基于组织微阵列进行了转录组谱分析和组织病理学研究，以探索转移相关成纤维细胞（MAFs）在ECM重塑中与ENE形成的关联。从ENE阳性（ENE+）和ENE阴性（ENE?）淋巴结中分离原代MAFs进行功能表征。通过免疫组织化学、基因敲除以及与HSC-3肿瘤细胞的共培养实验，研究了YAP在MAF介导的ECM重塑中的调控作用。淋巴结中高度间质反应和丰富的胶原重塑与更高的ENE风险相关。与ENE? MAFs相比，ENE+ MAFs表现出更强的增殖能力、增强的迁移能力和增加的ECM重塑活性。共培养实验表明，ENE+ MAFs通过Matrigel显著促进HSC-3细胞侵袭。探索性RNA测序揭示ENE+淋巴结中ECM受体相互作用和Hippo-YAP通路富集。MAFs中的细胞核YAP定位与ECM组分（I型胶原α1链[COL1A1]、纤连蛋白1[FN1]、肌腱蛋白C）和基质金属蛋白酶-2的表达升高相关。在ENE+ MAFs中敲低YAP显著减弱了其ECM重塑能力和促侵袭能力（体外）。这些发现表明，YAP激活的MAFs可能通过ECM重塑创造有利于ENE形成的基质环境，但仍需直接的体内验证以建立因果关系。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
口腔鳞状细胞癌（OSCC）是全球常见的头颈部恶性肿瘤，年新发病例约37.77万例，早期即易发生淋巴结转移，发生率高达20%–40%。淋巴结转移中，结外扩展（ENE）定义为肿瘤细胞突破淋巴结包膜侵入结周脂肪组织，在原发灶淋巴结转移状态中预后最差，独立预测治疗失败、复发率升高和总生存期缩短。然而，ENE形成的机制尚不完全明确，可能涉及免疫微环境失调、淋巴结结构改变及间质重塑等多因素过程。间质反应（Desmoplasia）以癌症相关成纤维细胞（CAFs）过度扩增和细胞外基质（ECM）异常沉积为特征，在胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤及OSCC等实体瘤中常见。转移淋巴结中亦存在间质反应，其程度与转移灶大小和患者预后相关，但间质反应对ENE形成的具体贡献尚未阐明。Yes相关蛋白（YAP）作为Hippo通路的关键效应因子，在肿瘤微环境（TME）中调控CAF功能：在前列腺癌中，YAP活性维持ECM-CAF表型；在乳腺癌中，YAP激活建立维持CAF表型和驱动基质硬化的正反馈环路。研究人员此前通过单细胞测序发现OSCC转移淋巴结中存在丰富的转移相关成纤维细胞（MAFs），其转录谱与原发灶CAFs显著不同。基于此，研究人员提出假设：MAFs中YAP激活可能参与ECM重塑，并与ENE形成相关。该研究系统探索了YAP激活的MAFs在OSCC-ENE发展中的作用。论文发表于《The Journal of Pathology: Clinical Research》。
**关键技术方法**
研究人员回顾性分析了344例OSCC患者（南京口腔医院2015–2016年手术切除标本），根据淋巴结状态分为无转移组（NLN，n=242）、无结外扩展的转移组（ENE?，n=45）和有结外扩展的转移组（ENE+，n=57）。对3例OSCC患者配对ENE+和ENE?转移淋巴结进行转录组测序（RNA-seq，Illumina NovaSeq 6000平台，150bp双端测序）。构建包含95例转移淋巴结标本的组织微阵列（TMA），采用自动免疫组化（IHC）分析（Halo软件）评估ECM重塑相关蛋白表达。分离原代MAFs进行体外功能实验，包括增殖（CCK-8）、迁移（Transwell、划痕愈合）、ECM重塑（胶原凝胶收缩）、共培养侵袭实验。利用CRISPR/Cas9慢病毒系统建立YAP敲低MAFs细胞系，验证YAP功能。
**研究结果**
**胶原重塑在间质反应性转移淋巴结中与ENE形成相关**
通过回顾性分析108例OSCC淋巴结转移患者，发现转移淋巴结中间质反应程度高者预后更差（总生存期、无病生存期降低）。采用肿瘤相关胶原特征（TACS）评分系统评估胶原重塑，发现高TACS评分的转移淋巴结中ENE比例更高；ENE+区域显示更明显的胶原沉积和重塑，而包膜完整或内部区域胶原排列不同。结果表明ECM重塑（特别是胶原重组）与OSCC转移淋巴结的ENE状态存在关联，但间质重塑与包膜破坏的时间关系尚需明确。
**ENE+ MAFs体外表现出增强的增殖活性和促侵袭能力**
从ENE+和ENE?淋巴结分离原代MAFs，免疫荧光验证典型成纤维细胞表型（αSMA、FAP、FSP1、PDGFRβ）。ENE+ MAFs增殖能力显著增强（24h时细胞活力提高2.15倍），迁移能力更强（Transwell迁移增加2倍，划痕愈合率94.8% vs 48.8%）。胶原凝胶收缩实验中，ENE+ MAFs使凝胶收缩至原始大小的58.4%，显著强于ENE? MAFs的33.2%（p<0.001）。共培养实验中，ENE+ MAFs显著促进HSC-3细胞穿过Matrigel的侵袭（145±34细胞/视野 vs ENE?组49±17细胞/视野，p<0.001），但MAFs条件培养基不影响HSC-3迁移。结果表明αSMA阳性的ENE+ MAFs高度活化，并可能体外促进肿瘤细胞侵袭。
**RNA测序揭示Hippo为ENE+淋巴结的候选通路**
对2对转移淋巴结进行RNA-seq，差异表达分析发现ENE+淋巴结中上调基因2702个、下调基因2464个。KEGG富集分析显示ECM受体相互作用和黏着斑通路显著富集，Hippo信号通路亦富集，多个YAP/TAZ靶基因（TEADs、AJUBA、YAP1、FZD1、CTGF）上调。免疫荧光显示ENE+区域YAP+αSMA+细胞显著富集；TMA-IHC定量表明ENE+淋巴结中细胞核YAP+间质细胞比例（26.9%）显著高于ENE?（9.1%），而肿瘤细胞中核YAP阳性率无差异。提示YAP在间质细胞（非肿瘤细胞）中的激活与ENE状态相关。
**YAP激活的MAFs在ENE发展过程中与ECM重塑偶联**
TMA-IHC自动分析显示，ENE+淋巴结中ECM沉积标志物COL1A1、TNC、FN阳性面积显著增加，MMP9表达显著降低；YAP+ MAFs的阳性细胞比例和阳性细胞密度均显著升高。相关性分析表明YAP活性细胞数目与ECM重塑蛋白（COL1A1、FN、TNC、MMP2、MMP9）表达水平呈显著相关，提示YAP激活与ECM重组在ENE状态中存在关联。
**消除MAFs中YAP激活减弱ECM重塑和促侵袭活性**
Western blot显示ENE+ MAFs中总YAP蛋白表达显著升高，细胞核YAP定位比例更高。建立稳定YAP敲低MAFs细胞系后，YAP缺失显著抑制MAFs增殖（72h减少43.9%），胶原凝胶收缩能力降低22%（p<0.05），ECM重塑蛋白表达下降。三维侵袭实验表明，YAP敲低的ENE+ MAFs丧失了对HSC-3细胞的促侵袭作用，其促侵袭能力降至与ENE? MAFs相当的水平。体外功能实验证实YAP激活是ENE+ MAFs增强ECM重塑和促侵袭特性所必需的，但尚需体内实验验证YAP依赖的间质程序是否足以驱动ENE形成。
**讨论与结论**
讨论指出：该研究揭示YAP激活的MAFs与ECM重塑特征相关联，可能营造有利于OSCC淋巴结转移中ENE形成的基质环境。ENE+ MAFs增强的增殖和迁移能力表明转移微环境中成纤维细胞的主动选择或重编程；与原发性肿瘤CAFs促进初始侵袭不同，MAFs可能参与ECM重塑以帮助肿瘤细胞突破淋巴组织解剖屏障。ENE+ MAFs中MMP2、COL1A1、FN1、TNC高表达提示同时进行基质沉积和选择性降解的协调程序。MMP9在ENE+淋巴结中低表达，可能反映其在不同肿瘤类型中的背景依赖性异质性。YAP敲低主要减少促侵袭功能而不诱导抗肿瘤特性，暗示YAP在成纤维细胞中的组织特异性作用。ENE形成可能是多因素过程，包括肿瘤细胞亚群的固有侵袭能力、免疫逃逸、转移灶扩张的机械力及代谢重编程等。结论部分翻译如下：总之，这些发现表明YAP激活的αSMA阳性MAFs参与ECM重塑，该重塑与OSCC中ENE形成相关，并可能促进其发生。将YAP导向策略与当前治疗范式相结合有望改善淋巴结阳性OSCC患者的预后，但需体内验证这些体外观察结果。
