手术切除胃肠胰神经内分泌肿瘤中细胞黏附分子1低表达与淋巴结及远处转移的关系

《Pathology International》：Low Expression of Cell Adhesion Molecule 1 in Resected Gastroenteropancreatic Neuroendocrine Tumors: Relationship With Lymph Node and Distant Metastasis

　　

摘要：胃肠胰神经内分泌肿瘤(GEP-NETs)具有临床异质性，使得转移行为的预测具有挑战性。本研究检测了75例手术切除GEP-NETs中细胞黏附分子1(CADM1)与肺癌差异表达基因1(DAL-1，differentially expressed in adenocarcinoma of the lung-1)的表达，并评估其与临床病理特征、肿瘤分级以及已建立的黏附或预后相关标志物包括E-钙黏蛋白(ECAD，E-cadherin)、CD56、孕激素受体(PgR，progesterone receptor)和细胞角蛋白19(CK19，cytokeratin 19)的关联。研究人员采用甲基化特异性PCR(MSP，methylation-specific PCR)评估CADM1启动子甲基化状态，并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析microRNA(miR)-214和miR-375的表达。结果显示，CADM1表达在有淋巴结和/或远处转移的肿瘤中显著降低(p＝0.01)，且CADM1低表达与转移性疾病独立相关(p＝0.0004；OR＝4.63)。此外，如前文报道，低PgR表达(p＝0.014；OR＝4.13)和高CK19表达(p＝0.0002；OR＝4.83)与不良结局相关。相反，ECAD和CD56在单变量评估中均未显示出与侵袭性特征的显著关联。CADM1启动子甲基化与CADM1表达之间未观察到显著关系。这些发现表明，CADM1表达降低可能与GEP-NETs的淋巴结及远处转移有关，并可能作为一个潜在的预后标志物。

研究背景与开展意义：胃肠胰神经内分泌肿瘤（GEP-NETs，gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors）是一类起源于弥散神经内分泌细胞、具有高度临床异质性的肿瘤，可发生于消化道及胰腺等多个部位。目前2019版世界卫生组织（WHO）分类依据核分裂计数和Ki-67标记指数将其分为G1、G2、G3三级，TNM分期与WHO分级虽广泛应用，但对低级别肿瘤复发转移的预测仍不充分，现有黏附相关分子如E-钙黏蛋白（ECAD，E-cadherin）、CD56等的预后价值结论不一，因此亟需新的预后指标。细胞黏附分子1（CADM1，cell adhesion molecule 1）是免疫球蛋白超家族成员，具有肿瘤抑制作用，其表达缺失与多种恶性肿瘤不良预后相关，且在胰腺胰岛细胞中有表达并参与内分泌调节，但此前尚无研究在GEP-NETs中系统探讨CADM1及其结合蛋白肺癌差异表达基因1（DAL-1，differentially expressed in adenocarcinoma of the lung-1）的表达及预后意义。研究人员据此假设CADM1和DAL-1在GEP-NETs中表达并具有预后价值，进而设计本研究，成果发表于《Pathology International》。研究发现CADM1低表达与淋巴结和远处转移等不良结局独立相关，可为GEP-NETs预后评估提供潜在新标志物。

主要关键技术方法：研究人员回顾性收集75例2001年至2020年间手术切除、经神经内分泌标志物确诊的分化良好GEP-NETs石蜡标本（胰腺45例，胃肠道30例），并有完整临床病理及随访资料；采用免疫组织化学（IHC，immunohistochemistry）检测CADM1、DAL-1、ECAD、CD56、PgR（孕激素受体，progesterone receptor）、CK19（细胞角蛋白19，cytokeratin 19）、SSTR2（生长抑素受体2，somatostatin receptor 2）、DAXX（死亡结构域相关蛋白，death domain-associated protein）、ATRX（α-地中海贫血/智力障碍综合征X连锁，α-thalassemia/mental retardation syndrome X-linked）及直肠NETs亚型标志物（PYY、血清素、生长抑素）的表达并依据判读标准评分；选取宏切割后FFPE样本提取DNA，以甲基化特异性PCR（MSP，methylation-specific PCR）分析CADM1启动子甲基化状态；提取总RNA以实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测miR-214和miR-375表达并以RNU6B为内参；统计学上用ROC曲线Youden指数确定IHC cutoff值，采用Mann–Whitney U检验、Fisher精确检验、Spearman相关及Firth逻辑回归等多因素分析评估与不良结局（同步淋巴结和/或远处转移、异时远处转移）的关联。

研究结果：3.1 患者与肿瘤特征（Patients and Tumor Characteristics）：75例中胰腺45例、直肠17例、十二指肠4例、胃3例、小肠3例、结肠3例；中位Ki-67为1.2%（0.2%–68.6%），G1占58例、G2 13例、G3 4例；同步淋巴结转移8例、同步远处转移3例、异时远处转移5例，总不良结局10例（13.3%），疾病特异性死亡3例，说明队列以低级别为主但含一定转移比例。3.2 GEP-NETs中CADM1和DAL-1的表达（Expression of CADM1 and DAL-1 in GEP-NETs）：IHC显示CADM1和DAL-1主要定位于肿瘤细胞膜，部分伴胞质染色。3.3 IHC结果与临床病理因素的关联（Association Between IHC Results and Clinicopathological Factors）：CADM1阳性率中位数在淋巴结转移组（25%）和无转移组（70%）差异显著（p＝0.016），远处转移组更低（22.5% vs 70%，p＝0.013）；DAL-1无显著差异；ECAD无显著关联；CD56高表达见于肿瘤>10 mm及G2/G3（p＝0.006、0.003）；PgR在近转移/远处转移中几乎缺失（p＝0.02、0.005）；CK19高表达与转移及高级别相关（p＝0.001、0.006、0.006）；胰腺NETs的CADM1、DAL-1、PgR显著高于胃肠道NETs（均p＜0.001）。3.4 CADM1、DAL-1、ECAD、CD56、PgR、CK19表达与Ki-67标记指数的关系（Relationship Between the CADM1, DAL-1, ECAD, CD56, PgR, and CK19 Expression and the Ki-67 Labeling Index）：CADM1与DAL-1（r＝0.342，p＝0.00268）、ECAD（r＝0.297，p＝0.00969）、CD56（r＝0.372，p＝0.00101）呈弱正相关，与PgR、CK19、Ki-67无显著相关。3.5 IHC阳性cutoff值定义（Definition of the Cutoff Value for IHC Positivity）：ROC分析确定CADM1为50%，DAL-1为15%，ECAD和CK19为40%，CD56和PgR为30%。3.6 不良结局相关IHC表达与临床因素的单变量分析（A Univariate Analysis of the Immunohistochemical Expression and Clinical Factors Associated With Adverse Outcomes）：低CADM1（p＝0.00112）、低PgR（p＝0.0107）、高CK19（p＝0.000127）、高级别（p＝0.0413）、肿瘤>10 mm（p＝0.00384）与不良结局显著相关；DAL-1、ECAD、CD56、SSTR2、性别、年龄、部位无显著关联。3.7 不良结局相关IHC表达与临床因素的多变量分析（A Multivariate Analysis of the Immunohistochemical Expression and Clinical Factors Associated With Adverse Outcomes）：Firth回归显示低CADM1（模型1加大小、分级：p＝0.0003，OR＝4.19；模型4同入CADM1、PgR、CK19：p＝0.0004，OR＝4.63）、低PgR（模型2：p＝0.0033，OR＝4.06；模型4：p＝0.014，OR＝4.13）、高CK19（模型3：p＝0.0001，OR＝4.45；模型4：p＝0.0002，OR＝4.83）独立关联不良结局；肿瘤>10 mm在多模型中亦显著（p＜0.01，OR≈3.06–3.74），分级失去独立意义。3.8 P-NETs中DAXX/ATRX状态与CADM1表达及不良结局的关联（Association of DAXX/ATRX Status With CADM1 Expression and Adverse Outcomes in P-NETs）：DAXX和/或ATRX缺失的P-NETs中位CADM1阳性率70%（范围10%–95%）显著低于双保留组92.5%（10%–100%）（p＝0.0245）；DAXX/ATRX状态与不良结局无统计显著关联（p＝1）。3.9 直肠NETs中CADM1表达按L细胞与EC细胞分类（The CADM1 Expression According to L-Cell and EC-Cell Classification in Rectal NETs）：17例直肠NETs中14例L细胞型CADM1中位55%（5%–90%），1例EC细胞型100%，2例null型分别为5%和35%，因EC细胞型仅1例无法统计比较。3.10 CADM1基因启动子甲基化及其与CADM1表达和原发部位的关系（Methylation of the CADM1 Gene Promoter and Its Association With the CADM1 Expression and the Primary Tumor Site）：64例可评估中甲基化8例（13%），甲基化组CADM1阳性率中位数47.5%低于非甲基化组70.0%但无显著差异（p＝0.402）；胃肠道NETs甲基化率30.4%（7/23）显著高于胰腺NETs 2.4%（1/41）（p＝0.002），提示部位差异但甲基化不是CADM1蛋白下调主要机制。3.11 miRNA表达及其与CADM1表达的关系（The Expression of miRNAs, and Their Relationship With the CADM1 Expression）：P-NETs中低CADM1组miR-375中位数高于高CADM1组（p＝0.189），无显著差异；miR-214与CADM1无显著关联，各部位间miRNA也无显著差异。

讨论部分总结：研究人员在讨论中指出，CADM1低表达与不良结局（淋巴结及远处转移）的独立关联与多种其他恶性肿瘤中CADM1的抑癌作用一致，且这种关联在调整肿瘤大小、分级及PgR、CK19后仍显著，支持CADM1可作为GEP-NETs潜在预后标志物；DAL-1虽无显著独立关联但有趋势，可能需要更大样本；ECAD和CD56未显示与转移显著相关，提示其预后价值有限且可能因肿瘤起源和队列而异；CADM1与SSTR2（生长抑素受体2，somatostatin receptor 2）无关联，说明CADM1反映不同于SSTR2的生物学特征；P-NETs中DAXX/ATRX缺失者CADM1更低，两者均与不良预后相关但机制未直接相连，可能均涉及上皮–间质转化（EMT，epithelial–mesenchymal transition）相关途径；直肠NETs亚型与CADM1的关系因样本限制无法得出结论；CADM1启动子甲基化在GEP-NETs少见且与蛋白表达无显著相关，说明表观甲基化不是主要下调机制；miR-375在P-NETs低CADM1组有升高趋势但未达显著，与既往小鼠胰岛中miR-375靶向CADM1的报道方向一致，提示其他miRNA或非转录机制可能参与；胰腺NETs的CADM1、DAL-1、PgR高于胃肠道NETs，体现部位分子异质性；研究局限性包括各器官病例数少、不良结局数有限、仅含可切除标本可能低估晚期转移、部分无淋巴结清扫者归为阴性、随访时间不均等；结论为CADM1低表达与GEP-NETs淋巴结及远处转移等不良结局相关且具备独立预后价值，有望成为辅助预后标志物，但需在更大独立队列中验证。