仙莲解毒汤(Xianlian Jiedu Decoction, XLJDD)通过调控S1P(Sphingosine-1-phosphate, 鞘氨醇-1-磷酸)依赖的JNK/p38 MAPK(Mitogen-Activated Protein Kinase, 丝裂原活化蛋白激酶)信号通路诱导结直肠癌凋亡

《Journal of Ethnopharmacology》：Xianlian Jiedu Decoction induces apoptosis in colorectal cancer via modulation of sphingosine-1-phosphate-dependent JNK/p38 MAPK signaling

　　

民族药理学相关性：仙莲解毒汤(Xianlian Jiedu Decoction, XLJDD)是临床常用于治疗结直肠癌(Colorectal Cancer, CRC)的传统中药复方，但其治疗作用的具体分子机制尚不完全清楚。研究目的：探讨传统中药复方XLJDD作用于CRC的分子靶点与信号通路。材料与方法：制备XLJDD含药血清作用于CRC细胞系(HCT116和HT29)，CCK-8法确定最佳浓度；分别采用Hoechst 33342染色、TUNEL assay、JC-1检测及Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术评估细胞凋亡；ELISA检测细胞上清中S1P分泌水平；建立CT26小鼠皮下移植瘤模型并给予XLJDD汤剂灌胃，监测肿瘤生长曲线并称量最终瘤重；肿瘤组织行HE染色观察病理改变，免疫组化(IHC)检测Ki-67、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达；Bulk RNA-seq联合转录组及GO/KEGG富集分析筛选差异信号通路，Western blot在蛋白水平验证。综合实验阐明XLJDD通过调控MAPK及相关凋亡信号通路发挥抗CRC作用。结果：XLJDD含药血清呈剂量依赖性显著抑制CRC细胞活力并促进凋亡；ELISA显示XLJDD含药血清降低CRC细胞培养上清中S1P水平；体内实验表明XLJDD处理组荷瘤小鼠肿瘤生长延缓、瘤重减轻、肿瘤组织形态学改善，且XLJDD呈剂量依赖性拮抗S1P的促肿瘤作用；IHC及Western blot显示XLJDD下调Ki-67和Bcl-2表达，促进Caspase-3活化，抑制JNK/p38 MAPK信号通路；Bulk RNA-seq转录组及通路富集分析进一步证实XLJDD通过调控S1P介导的JNK/p38 MAPK通路抑制肿瘤进展，为其临床应用提供实验依据。结论：XLJDD通过下调S1P水平、调节JNK/p38 MAPK信号通路、增强肿瘤细胞凋亡，抑制CRC的发生发展。

仙莲解毒汤(XLJDD)通过调控S1P依赖的JNK/p38 MAPK信号通路诱导结直肠癌凋亡——论文解读

该研究发表于《Journal of Ethnopharmacology》。结直肠癌(Colorectal Cancer, CRC)是全球高发且致死率较高的恶性肿瘤，尽管手术、化疗、靶向及免疫治疗取得进展，但严重不良反应和耐药问题仍限制疗效，亟需低毒、多靶点的治疗策略。传统中药(Traditional Chinese Medicine, TCM)因整体调节、多靶点作用和良好安全性成为CRC辅助治疗的理想选择。仙莲解毒汤(Xianlian Jiedu Decoction, XLJDD)系由黄芪(Astragalus mongholicus)、白术(Atractylis macrocephala)、苦参(Sophora flavescens)、三棱(Sparganium stoloniferum)、郁金(Curcuma aromatica)、薏苡仁(Coix lacryma-jobi)、黄连(Coptis chinensis)、仙鹤草(Agrimonia pilosa)组成的经典复方，临床已用于CRC整合治疗并可减轻化疗毒副作用、改善生存，但其上游分子介导机制尚未明确。鞘氨醇-1-磷酸(Sphingosine-1-phosphate, S1P)作为重要的生物活性鞘脂代谢产物，在多种恶性肿瘤中异常升高并通过激活ERK、NF-κB及MAPK(Mitogen-Activated Protein Kinase, 丝裂原活化蛋白激酶)等促癌通路发挥作用；其中JNK(c-Jun N-terminal kinase, c-Jun氨基末端激酶)和p38 MAPK是调控细胞增殖、分化及凋亡的关键应激通路。已有研究表明XLJDD可通过CXCR2/PI3K/AKT等通路抑制CRC，但S1P等上游脂质信号分子是否介导XLJDD对JNK/p38 MAPK通路的调控尚不明确。为此，研究人员系统探究XLJDD经S1P-JNK/p38 MAPK轴诱导CRC细胞凋亡并抑制肿瘤生长的分子机制。

研究人员主要采用以下关键技术方法开展研究：制备SD大鼠XLJDD含药血清及对照空白血清；体外以人CRC细胞系HCT116、HT29为对象，CCK-8法测细胞活力确定含药血清工作浓度(10%、15%、20%，作用48 h)，Hoechst 33342染色、TUNEL法、JC-1线粒体膜电位检测及Annexin V-FITC/PI双标流式细胞术检测细胞凋亡，ELISA检测上清S1P浓度，Western blot检测凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、Caspase-3)及JNK/p38 MAPK通路蛋白(total JNK、phospho-JNK Thr¹⁸³/Tyr¹⁸⁵、total p38、phospho-p38 Thr¹⁸⁰/Tyr¹⁸²)表达；使用S1P合成酶抑制剂PF-543(10 μM)进行干预验证S1P依赖性；体内建立BALB/c小鼠CT26皮下移植瘤模型(n=6/组)，设模型组、S1P皮下注射组、XLJDD低/高剂量+S1P组、XLJDD低/高剂量组及5-FU阳性对照组，监测体重与肿瘤体积，剥离瘤体称瘤重，HE染色及免疫组化检测Ki-67、Bcl-2、Caspase-3；取肿瘤组织进行Bulk RNA-seq转录组测序，行差异表达基因(DEGs)筛选、Venn取S1P上调/XLJDD逆转及S1P下调/XLJDD逆转基因、GO与KEGG富集分析。

3.1. XLJDD drug-containing serum significantly inhibits CRC cell viability

研究人员用不同体积分数(5%、10%、15%、20%)XLJDD含药血清处理HCT116和HT29细胞24 h和48 h，CCK-8检测发现10%、15%、20%含药血清呈浓度和时间依赖性显著抑制CRC细胞活力(P<0.05或P<0.001)，5%无显著影响，故选定10%、15%、20%作用48 h进行后续实验。结论：XLJDD含药血清可浓度依赖性地抑制CRC细胞存活。

3.2. XLJDD drug-containing serum induces CRC cells apoptosis

Hoechst 33342染色可见含药血清组出现典型凋亡核固缩、浓染蓝染；TUNEL染色绿色荧光显著增多；JC-1检测显示红色聚集体减少、绿色单体增多，提示线粒体膜电位下降即线粒体去极化；Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术显示早期凋亡细胞(Annexin V⁺PI^-)比例呈浓度依赖性升高，20%组最高，与5-FU阳性对照趋势一致。结论：XLJDD含药血清通过引起线粒体功能障碍，浓度依赖性地促进CRC细胞凋亡。

3.3. XLJDD delays tumor progression by reducing the level of secreted S1P

ELISA检测HCT116和HT29细胞上清S1P含量，XLJDD含药血清处理组S1P水平较对照组显著降低(P<0.05或P<0.001)。小鼠移植瘤实验中，S1P单独注射组肿瘤体积最大、瘤重最重、HE染色见细胞密集核异型明显；XLJDD单用组肿瘤最小最轻，组织见低密度瘤细胞及坏死区；XLJDD+S1P组较S1P组肿瘤生长受抑且呈XLJDD剂量依赖性；各期间小鼠体重无显著差异。IHC显示S1P组Ki-67和Bcl-2高表达、Caspase-3低表达，XLJDD单用则下调Ki-67和Bcl-2、上调Caspase-3，XLJDD+S1P组被部分逆转。结论：XLJDD通过降低S1P水平、拮抗S1P促肿瘤作用，抑制CRC体内外进展。

3.4. Transcriptional analysis reveals the MAPK signaling pathways involved in the anti-tumor effects of XLJDD

对模型组、S1P组及XLJDD+S1P组小鼠肿瘤组织行Bulk RNA-seq，筛选S1P组vs模型组的差异表达基因(DEGs)及XLJDD+S1P组vs模型组的DEGs，取S1P上调而XLJDD逆转下调、S1P下调而XLJDD逆转上调的基因(共222个)作GO和KEGG分析。GO富集涉及细胞增殖负调控、血管内皮功能、细胞外基质组织等；KEGG富集最显著条目为MAPK信号通路。结论：XLJDD拮抗S1P所逆转的差异基因显著富集于MAPK信号通路，提示该通路参与XLJDD抗CRC效应。

3.5. XLJDD drug-containing serum exerts the anti-tumor effects by inhibiting the JNK/p38 MAPK pathway

Western blot检测含药血清处理的HCT116和HT29细胞，Bax和Cleaved Caspase-3表达上调、Bcl-2下调；磷酸化JNK(p-JNK Thr¹⁸³/Tyr¹⁸⁵)和磷酸化p38(p-p38 Thr¹⁸⁰/Tyr¹⁸²)随含药血清浓度升高而递减，总JNK和总p38蛋白水平不变。结论：XLJDD含药血清通过抑制JNK和p38的磷酸化活化而非改变其总蛋白量，下调抗凋亡Bcl-2、上调促凋亡Bax及活化的Caspase-3，从而促进CRC细胞凋亡。

3.6. Anti-tumor effects of XLJDD drug-containing serum depend on the JNK/p38 MAPK pathway regulated by S1P

用SphK1(Sphingosine kinase 1, 鞘氨醇激酶1)选择性抑制剂PF-543(10 μM)抑制细胞内S1P生成，分别与20% XLJDD含药血清及二者联用处理细胞。单独PF-543或单独XLJDD含药血清均降低p-JNK和p-p38、上调Bax和Caspase-3、下调Bcl-2；联用组p-JNK和p-p38磷酸化水平较单独XLJDD组回升，Bax和Caspase-3下调、Bcl-2上调，TUNEL荧光强度较单独XLJDD组减弱。结论：抑制S1P可削弱XLJDD对JNK/p38 MAPK通路的抑制及对凋亡的促进作用，XLJDD的抗肿瘤效应部分依赖于完整的S1P-JNK/p38 MAPK信号轴，提示XLJDD还存在其他并行作用途径。

讨论部分指出，本研究首次明确S1P调控的JNK/p38 MAPK信号轴是XLJDD抗CRC的关键机制，弥补了既往对上游脂质信号分子在TCM抗肿瘤中作用的认知不足。采用含药血清法更贴近临床体内药动学过程，且10%–20%体积分数符合血清药理学规范以避免非特异性影响。S1P-S1PR-MAPK网络在哺乳动物中高度保守，支持体内外结果的可转化性。XLJDD中已知成分如黄连小檗碱(Berberine)、黄连黄连碱(Coptisine)及苦参苦参碱(Matrine/Oxymatrine)等已被报道可调节MAPK及凋亡通路，与本研究发现JNK/p38抑制相吻合，提示XLJDD为多组分协同作用。临床中XLJDD用于IIIB/IIIC期CRC辅助治疗可降低术后复发、延长生存并减轻化疗毒副反应，临床前未观察到明显肝肾毒性，与本研究动物体重稳定相符。局限在于含药血清活性成分解及组织分布未完全阐明，尚需患者来源类器官及多中心临床试验进一步验证。本研究为XLJDD提供了S1P-JNK/p38 MAPK轴的实验证据，也为以脂质信号为靶点的CRC治疗提供了新思路。

结论部分原文翻译：仙莲解毒汤(XLJDD)通过下调鞘氨醇-1-磷酸(S1P)水平、调控JNK/p38 MAPK信号通路、增强肿瘤细胞凋亡，抑制结直肠癌(CRC)的发生与发展。