食欲素B通过抑制SP-1减少脑动脉瘤

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Orexin B Reduces Cerebral Aneurysms Through Inhibition of SP-1

　　

脑动脉瘤（Cerebral aneurysms, CAs）是颅内动脉的病理性扩张，具有较高的破裂风险，但其形成的分子机制尚未完全阐明。食欲素B/OX2R（Orexin B/OX₂R）系统已知可调节觉醒和代谢，最近被证实参与血管病理过程，但其在脑动脉瘤中的作用尚未被探索。研究人员检测了38例脑动脉瘤患者和43例健康对照者的血清食欲素A和B水平。利用野生型（WT）和OX₂R基因敲除（OX₂R^?/?）小鼠建立弹性蛋白酶诱导的脑动脉瘤模型，并给予或不给予食欲素B治疗（30 μg/kg/天，持续7周）。评估指标包括动脉瘤大小、炎症介质（IL-6、MMP-9、MCP-1、E-选择素）、巨噬细胞浸润（CD68）及SP-1表达。体外实验采用人脑微血管内皮细胞（HBMVECs），检测血管紧张素II（Ang II）诱导的OX₂R抑制、单核细胞黏附以及食欲素B处理和SP-1过表达后的SP-1介导信号传导。研究结果显示，脑动脉瘤患者和小鼠的血清食欲素B水平显著降低（脑动脉瘤患者：3.21±0.52 pg/mL vs. 对照组：8.56±1.23 pg/mL，p<0.01），而食欲素A水平无变化。脑动脉瘤小鼠Willis环区域OX₂R表达下调。食欲素B给药可减轻野生型小鼠动脉瘤形成（大小从3.72±0.469 mm降至1.93±0.252 mm，p<0.01），但对OX₂R^?/?小鼠无效。食欲素B可抑制野生型小鼠IL-6、MMP-9、MCP-1和E-选择素表达，减少CD68⁺巨噬细胞浸润，并降低SP-1水平，但在OX₂R^?/?小鼠中无此效应。在HBMVECs中，Ang II呈剂量依赖性降低OX₂R表达。食欲素B抑制Ang II诱导的单核细胞黏附及SP-1介导的促炎信号传导，该效应可被OX₂R siRNA或SP-1过表达消除。研究结论指出，食欲素B/OX₂R轴在脑动脉瘤中发生调控紊乱，食欲素B通过OX₂R依赖的抗炎机制抑制SP-1发挥抗脑动脉瘤形成作用，该通路可作为脑动脉瘤的潜在治疗靶点。

该研究聚焦于脑动脉瘤（Cerebral aneurysms, CAs）的病理机制探索与潜在治疗靶点发现。脑动脉瘤作为颅内动脉的局灶性扩张病变，其破裂可导致蛛网膜下腔出血，具有高致残率和高死亡率，在普通人群中的患病率约为3%—5%。尽管其危害严重，但调控脑动脉瘤形成、进展及破裂的精确机制尚未完全阐明。现有研究指出，脑动脉瘤发病涉及遗传易感性、血流动力学应激及炎症反应等多因素作用，其中炎症反应通过巨噬细胞浸润、细胞因子释放及基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases, MMPs）活化降解细胞外基质，在血管壁损伤和动脉瘤形成中发挥关键作用。食欲素（Orexin）系统由食欲素A和B及其受体OX₁R和OX₂R组成，传统研究集中于其在觉醒调节和能量稳态中的功能，近年逐渐揭示其在血管功能中的潜在作用。然而，食欲素B在血管生理学特别是在脑动脉瘤背景下的作用几乎未被探索。SP-1（Specificity protein-1）作为调控炎症及细胞外基质相关基因表达的转录因子，其在血管失稳中的作用日益受到关注。基于此，研究人员假设食欲素B/OX₂R轴的调控紊乱可能参与脑动脉瘤的发病机制，并开展了系统研究。该论文发表于《CNS Neuroscience》。

研究所用关键技术方法主要包括：临床样本队列研究（38例脑动脉瘤患者及43例健康对照者的外周血血清样本）；弹性蛋白酶诱导的小鼠脑动脉瘤模型（采用野生型C57BL/6小鼠及OX₂R基因敲除小鼠）；酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清及脑脊液食欲素水平；定量实时PCR（qRT-PCR）及蛋白质免疫印迹（Western blot）分析基因和蛋白表达；组织学分析包括Verhoeff-van Gieson染色评估弹性纤维、免疫组织化学检测CD68⁺巨噬细胞浸润、免疫荧光检测OX₂R与CD31共定位；体外实验采用人脑微血管内皮细胞（HBMVECs）及THP-1单核细胞进行黏附实验；慢病毒载体介导的SP-1过表达；OX₂R siRNA转染介导的基因沉默。

**3.1 脑动脉瘤患者血清食欲素B水平降低**

研究人员首先检测了正常个体与脑动脉瘤患者的血清食欲素A和B水平。结果显示，血清食欲素A水平在正常对照组（29.5±4.21 pg/mL）与脑动脉瘤患者（31.7±5.33 pg/mL，p>0.05）之间无显著差异；而脑动脉瘤患者的血清食欲素B水平（3.21±0.52 pg/mL）较正常对照组（8.56±1.23 pg/mL，p<0.01）显著降低。该结果表明食欲素B而非食欲素A可能参与脑动脉瘤病理生理过程。

**3.2 脑动脉瘤小鼠模型中食欲素B/OX₂R系统调控紊乱**

研究人员进一步建立小鼠脑动脉瘤模型验证上述发现。病理学检查显示脑动脉瘤小鼠动脉瘤穹隆存在血管壁层次显著减少、平滑肌细胞匮乏、弹性纤维断裂及内膜破坏等典型病变。与临床数据一致，脑动脉瘤小鼠血清食欲素A水平与对照组无显著差异（对照组：19.6±2.57 pg/mL；脑动脉瘤小鼠：21.4±2.86 pg/mL，p>0.05），但血清食欲素B水平显著降低（对照组：5.39±0.78 pg/mL；脑动脉瘤小鼠：2.88±0.45 pg/mL，p<0.01）；脑脊液食欲素A水平亦无显著变化，而脑脊液食欲素B水平在脑动脉瘤小鼠中显著降低（对照组：52.8±7.05 pg/mL；脑动脉瘤小鼠：28.6±3.08 pg/mL，p<0.01）。在Willis环（Circle of Willis, COW）区域，脑动脉瘤小鼠OX₂R mRNA及蛋白水平均显著下调，免疫荧光共染证实OX₂R表达于COW区域血管内皮细胞且在脑动脉瘤小鼠中显著减弱。

**3.3 食欲素B给药减轻野生型而非OX₂R敲除小鼠的脑动脉瘤形成**

为明确食欲素B在脑动脉瘤发展中的功能作用，研究人员对诱导脑动脉瘤的野生型和OX₂R^?/?小鼠给予食欲素B处理。术后7周各组收缩压及平均动脉压无显著差异，排除了血压因素对脑动脉瘤形成的混杂影响。Verhoeff-van Gieson染色显示，野生型脑动脉瘤小鼠经食欲素B治疗后动脉瘤形成减少。定量分析表明，脑动脉瘤组平均动脉瘤大小为3.72±0.469 mm，野生型脑动脉瘤小鼠经食欲素B处理后显著降至1.93±0.252 mm（p<0.01）；而OX₂R^?/?脑动脉瘤小鼠动脉瘤大小为3.46±0.485 mm，食欲素B处理未改变该大小。该结果证实食欲素B的抗脑动脉瘤效应依赖于OX₂R介导。

**3.4 食欲素B抑制Willis环区域炎症介质表达**

炎症是脑动脉瘤发病的关键因素。研究人员检测发现，脑动脉瘤组小鼠COW区域IL-6 mRNA水平较野生型组显著升高（2.7±0.29 vs. 1±0.09），食欲素B处理使其降至1.4±0.13；IL-6蛋白水平呈相同趋势（脑动脉瘤组：227.3±32.51 pg/mL；食欲素B处理组：128.5±18.33 pg/mL）。MMP-9 mRNA水平在脑动脉瘤组升高（3.3±0.32），食欲素B处理后降至1.8±0.22，蛋白水平变化一致。在OX₂R^?/?小鼠中，食欲素B对IL-6和MMP-9表达的抑制作用消失。Western blot分析显示脑动脉瘤小鼠COW区域SP-1蛋白增加，食欲素B处理以OX₂R依赖方式使其恢复正常。上述结果提示食欲素B的抗炎效应具有OX₂R依赖性。

**3.5 食欲素B抑制巨噬细胞浸润及趋化因子和黏附分子表达**

研究人员进一步评估了食欲素B对巨噬细胞浸润及趋化因子、黏附分子表达的影响。CD68免疫组织化学显示，脑动脉瘤组巨噬细胞数量较野生型组显著增加（3.1±0.35 vs. 1±0.24），食欲素B处理使其减少至1.7±0.21。MCP-1和E-选择素mRNA及蛋白水平在脑动脉瘤组升高，食欲素B处理后降低；该抑制作用在OX₂R^?/?小鼠中消失。OX₂R^?/?小鼠基线或脑动脉瘤诱导的IL-6和MMP-9水平与野生型小鼠无显著差异，表明基因敲除主要影响对食欲素B的反应性而非基础炎症状态。

**3.6 血管紧张素II降低人脑微血管内皮细胞OX₂R表达**

为阐明脑动脉瘤中OX₂R下调的机制，研究人员关注了血管紧张素II（Ang II）的作用。Ang II以50 nM和100 nM处理HBMVECs 24小时后，OX₂R mRNA水平呈剂量依赖性降低（50 nM组：0.71±0.075；100 nM组：0.46±0.043；对照组：1±0.14）；Western blot证实蛋白水平同样降低（50 nM组：0.74±0.072；100 nM组：0.51±0.055）。该结果证实Ang II在转录和翻译水平抑制OX₂R表达。

**3.7 食欲素B改善单核细胞黏附并降低SP-1表达**

研究人员探索了食欲素B对HBMVECs单核细胞黏附的影响。100 nM Ang II促进THP-1单核细胞对HBMVECs的黏附，50 nM和100 nM食欲素B预处理显著减轻该黏附。Ang II诱导MCP-1和E-选择素mRNA及蛋白水平升高，食欲素B处理逆转此效应。此外，食欲素B降低Ang II刺激的HBMVECs中SP-1 mRNA和蛋白表达；OX₂R siRNA敲除消除食欲素B对Ang II诱导SP-1蛋白上调的抑制作用，证实食欲素B通过OX₂R特异性调控SP-1。

**3.8 SP-1过表达消除食欲素B的抑制作用**

为确认SP-1在食欲素B保护作用中的角色，研究人员利用慢病毒载体在HBMVECs中过表达SP-1。Western blot证实SP-1成功过表达后，食欲素B对Ang II诱导的MCP-1和E-选择素蛋白升高的抑制作用被消除；SP-1过表达联合Ang II处理组即使在食欲素B存在时，THP-1细胞黏附数量仍显著增加，表明SP-1过表达抵消了食欲素B的保护效应。

讨论部分对研究发现进行了系统阐释。研究人员指出，该研究首次全面审视了食欲素B在脑动脉瘤发病中的作用，确立了食欲素B/OX₂R轴作为脑动脉瘤潜在治疗靶点的地位。食欲素B通过OX₂R依赖的抗炎机制发挥保护作用，涉及抑制关键炎症介质、减少巨噬细胞浸润及黏附分子表达，并最终靶向SP-1介导的促炎信号传导。该发现为脑动脉瘤病理生理学提供了新视角，将神经肽系统与血管炎症性疾病联系起来。研究人员同时指出研究局限性：单一动物模型的局限性、临床样本量较小、体外实验未能完全模拟动脉瘤微环境的细胞间复杂相互作用、未评估食欲素B长期治疗效应及对动脉瘤破裂风险的影响。未来研究方向包括探索食欲素B/OX₂R系统的上游调控因子、开发OX₂R特异性激动剂或靶向该轴及SP-1的基因治疗策略、探究与肾素-血管紧张素系统等血管重塑关键通路的交互作用，以及开展临床转化研究验证其治疗潜力。

研究结论部分指出，研究人员已确定食欲素B/OX₂R轴为脑动脉瘤的潜在治疗途径。食欲素B水平在脑动脉瘤患者和动物模型中均降低，且食欲素B给药可通过抗炎机制并抑制SP-1介导的促炎信号传导来阻止脑动脉瘤形成。然而，仍需进一步研究以全面理解食欲素B/OX₂R轴在脑动脉瘤中的功能，并基于本研究发现开发有效的治疗策略以充分利用该轴的潜力。