《Journal of Physiology》：Preeclampsia-derived small extracellular vesicles disrupt blood–brain barrier integrity and activate glial cells in vitro
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血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）的结构和功能完整性对于维持脑稳态至关重要。子痫前期（preeclampsia, PE）是妊娠期以新发高血压和内皮功能障碍为特征的病症，常涉及BBB破坏和神经系统并发症。小细胞外囊泡（small ext
血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）的结构和功能完整性对于维持脑稳态至关重要。子痫前期（preeclampsia, PE）是妊娠期以新发高血压和内皮功能障碍为特征的病症，常涉及BBB破坏和神经系统并发症。小细胞外囊泡（small extracellular vesicles, sEVs）已成为子痫前期期间BBB破坏的潜在驱动因素；然而，其对母体脑健康的影响，特别是在细胞层面的作用，仍有待深入研究。本研究旨在探究子痫前期来源的sEVs对BBB完整性以及脑内皮细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞细胞反应的影响。sEVs分别从健康女性和晚发型子痫前期女性血浆中分离，并采用跨孔培养和微流控（BBB-on-a-chip）系统的人源单培养、双培养或三培养模型进行研究。在这些模型中，EV相关信号在脑内皮细胞中被检测到，与细胞内摄取和转运一致。sEV来源的货物在血管内皮层的基底侧细胞中被检测到，提示可能存在跨屏障转运，尽管其潜在机制尚不清楚。暴露于子痫前期来源的sEVs（PE-sEVs）还与脑内皮细胞蛋白质组成和亚细胞定位的改变相关，伴随BBB功能特性的改变，包括通透性增加。最后，星形胶质细胞和小胶质细胞对PE-sEV暴露产生反应，表现为IBA1和GFAP表达增加、IL-6释放以及星形胶质细胞迁移增强。这些发现表明，循环sEVs（包括胎盘来源的sEVs）可能通过影响BBB完整性和神经胶质激活参与子痫前期的母体脑改变。这可能提示循环sEVs作为生物标志物的潜在相关性及其在疾病病理生理学中的作用。
血脑屏障（BBB）是维持中枢神经系统（CNS）完整性的关键结构，由脑内皮细胞（BECs）形成的紧密单层构成，限制血液与脑之间的分子和细胞交换。作为神经血管单元的重要组成部分，BBB包含BECs、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、平滑肌细胞和周细胞等多种细胞类型。在毛细血管水平，BECs具有维持脑功能所需化学和代谢平衡的独特特征，细胞间黏附分子和紧密连接形成高度选择性的物质调控系统。神经胶质细胞，包括星形胶质细胞和小胶质细胞（脑内固有免疫细胞），在维持BBB结构和功能完整性方面发挥关键作用。星形胶质细胞整合脑血流与神经元活动，调节BEC屏障通透性；小胶质细胞则对成人BBB完整性维护、清除跨BBB的细胞碎片和颗粒以及监测组织损伤具有重要作用。
小细胞外囊泡（EVs）在母胎通讯中发挥重要作用，其血浆浓度随妊娠进展而增加，在妊娠并发症中进一步升高，提示其可能参与病理生理过程。胎盘来源的sEVs携带调节性和潜在有害分子。既往研究表明外源性sEVs可跨越BBB并进入小鼠脑部，而胎盘sEVs在外周循环中的存在已得到确认，但其对脑结构（如PE中受损的BBB）的潜在影响尚不清楚。
子痫前期（PE）是全球约3-8%孕妇受累的严重妊娠疾病，导致15%的孕产妇死亡，对胎儿和母体发病率和死亡率构成重大风险。PE通常在妊娠20周后出现，以新发高血压伴广泛内皮功能障碍为特征，常伴有神经功能紊乱。有力证据表明PE通过BBB损伤影响脑健康，患者常出现脑改变影像学征象，包括后部可逆性脑病综合征（PRES），其特征为头痛、癫痫发作、意识状态改变、视觉障碍和血管源性水肿。PRES与神经炎症和小胶质细胞激活相关，被认为与BBB功能障碍有关。此外，有PE病史的女性面临脑血管疾病长期风险增加，近年研究证实PE妊娠后数年仍存在持续性全脑BBB渗漏。独立于血压水平的脑血流自动调节受损也已在PE患者中报道。然而，这些研究未能完全解释急性神经系统并发症之外的损伤机制。利用PE血浆的动物模型研究表明，PE与异常脑血管反应性、脑血流调节受损和BBB通透性增加相关，强烈提示PE对BBB产生深远而持久的影响，可能与长期脑血管改变风险相关。
该研究旨在探究晚发型PE患者血浆来源的sEVs对人BBB体外模型的影响，采用包含BECs、小胶质细胞和星形胶质细胞的静态和动态BBB-on-chip装置。动态BBB-on-a-chip技术基于微流控支持的生物芯片，提供可控且持续的sEV补充培养基灌注，有效模拟脑毛细血管血流条件并研究跨BBB转运。该研究发表于《Journal of Physiology》，增强了研究者对PE如何在结构和细胞层面影响脑的理解，这对疾病管理和保护母胎健康至关重要。
研究人员开展此项研究的主要技术方法包括：从耶拿大学附属医院产科招募的健康妊娠和子痫前期患者血浆样本（n=24，其中PE 17例，正常妊娠13例），通过差速超速离心分离sEVs；采用人脑微血管内皮细胞系hCMEC/D3、人小胶质细胞系HMC3和原代人星形胶质细胞建立培养模型；运用基于跨孔板的静态模型和基于微流控芯片的动态BBB-on-a-chip模型（剪切力4 dyn/cm2）；采用PKH67染料标记sEVs进行摄取和转运研究；通过跨内皮电阻（TEER）和异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-dextran）通透性实验评估屏障功能；利用免疫荧光检测紧密连接蛋白（occludin和claudin-5）、IBA1和GFAP表达；采用Jaccard指数进行共定位分析；通过扫描电子显微镜观察超微结构；运用酶联免疫吸附法检测IL-6释放；开展星形胶质细胞迁移实验（伤口愈合实验）；并进行纳米颗粒跟踪分析（NTA）和冷冻透射电镜（cryo-TEM）对sEVs进行表征，以及实时定量PCR检测miRNA。
研究结果部分：
循环sEVs浓度在PE中增加
通过临床数据比较，PE组收缩压显著高于正常妊娠组，但母体年龄、采样时孕周、产次等无显著差异。sEVs通过差速超速离心富集，具有特征性球形脂质双层形态。纳米颗粒跟踪分析显示PE组sEVs浓度显著增高，粒径分布相似但粒径较大。蛋白质印迹证实sEVs富集内体途径标志物（ALIX、CD63、TSG101），胎盘碱性磷酸酶（PLAP）验证胎盘源性sEVs存在。对四种胎盘miRNA的定量分析显示，PE-sEVs中miR-141-3p和miR-519d-3p水平高于NP-sEVs。
晚发型PE来源sEVs通过破坏结构完整性增加BEC屏障通透性
在静态模型中，PE血浆和PE-sEVs均显著降低TEER值并增加40 kDa FITC-dextran通透性，效应与细胞因子混合物（CyM）相当，而NP血浆和NP-sEVs无显著影响。免疫荧光显示PE-sEVs处理导致occludin、claudin-5及其共定位（Jaccard指数）显著降低，而NP-sEVs仅增加occludin表达并降低共定位。扫描电镜证实内皮单层完整性受损。
PE-sEV相关信号跨BEC屏障证据及小胶质细胞激活
在BEC与微胶质细胞共培养模型中，PKH标记的sEVs在BECs中呈核周定位，sss，提示细胞内摄取和转运；同时在基底侧微胶质细胞中检测到sEV信号，提示跨屏障转运。PE-sEVs处理后，微胶质细胞中胎盘特异性miRNA（尤其miR-519d-3p）显著增加。IBA1表达面积在PE-sEVs处理后显著增加，且细胞形态向阿米巴样改变，提示小胶质细胞激活。
PE-sEVs在动态器官芯片模型中影响BBB
动态模型中，BECs在流动条件下呈现极化形态（长轴与灌注方向一致），屏障通透性较静态模型降低。PE-sEVs处理后FITC-dextran通透性增加（P=0.0917），occludin和claudin-5表达降低。与静态模型不同，动态模型中处理对occludin和claudin-5空间共定位的影响与其表达谱变化一致。PKH标记sEVs在动态模型中仍被BECs内化。
多细胞BBB-on-a-chip揭示星形胶质细胞驱动的IL-6反应
在三培养（BECs/微胶质细胞/星形胶质细胞）BBB-on-a-chip模型中，3D共聚焦成像确认三种细胞的正确空间定位。PE-sEVs处理后，上腔（内皮侧）和下腔（胶质侧）IL-6均显著增加，且胶质侧浓度更高（1500-3000 pg/mL vs. 1000-1500 pg/mL）。单培养验证显示，BECs直接刺激后IL-6释放为500-700 pg/mL，而星形胶质细胞仅在PE-sEVs刺激后显著增加至2000-4000 pg/mL。sEVs本身IL-6含量极低且组间无差异，排除外源性来源。
PE-sEVs促进星形胶质细胞促炎转变
PE-sEVs暴露导致星形胶质细胞形态显著改变，表现为细胞突起增厚和回缩，GFAP表达显著上调。细胞迁移实验显示，PE-sEVs暴露组星形胶质细胞伤口闭合能力增强，8小时即达50%覆盖率，差异持续至24小时。
讨论与结论部分总结：
该研究探讨了循环sEVs（部分为胎盘来源）作为妊娠期母体循环与脑部之间通讯介质的作用，及其对BBB完整性和神经功能的病理生理影响。研究支持以下观点：晚发型PE来源的sEVs增加BEC单层通透性，穿越内皮层，并诱导包括小胶质细胞激活和星形胶质细胞反应性在内的神经胶质反应，表现为IL-6释放增加和细胞运动性增强。
研究人员指出，BBB作为PE靶器官的早期损伤位点，其与短期和长期神经系统并发症的联系因素尚不明确。认知下降与脑血管疾病相关，常涉及BBB破坏。影像学显示70%伴神经症状的PE病例存在脑水肿和出血，15%显示实质性坏死，提示BBB边界之外的细胞损伤。虽然证据支持循环滋养层和胎盘来源sEVs对母体BBB的影响，但其细胞靶点尚未完全明确。
该研究的技术优势在于采用动态器官芯片模型，允许在灌注诱导的内皮极化背景下评估EV与BEC的相互作用，并在星形胶质细胞和小胶质细胞存在的情况下进行，对选择性转运和下游炎症效应具有重要意义。然而，PE的复杂血流动力学和激素环境未在模型中完全重现，包括剪切应力波动、全身炎症、细胞因子等循环因子、血管生成失衡（如sFlt-1）和免疫细胞改变。仅关注sEVs也未涵盖EV异质性、生理浓度、生物分布或患者体内动力学。
未来研究需要包括sEV货物的多组学分析，以及更具生理相关性的体外和体内模型，以阐明PE-sEVs诱导BBB破坏和神经胶质激活的因素和机制，以及其作为生物标志物用于未来多系统并发症早期诊断的潜力。
研究结论翻译：循环PE-sEVs影响人源体外模型中BECs的BBB相关特性，并在神经胶质细胞中诱导促炎样反应。这些发现提示sEVs在介导外周循环与母体脑之间通讯中的潜在作用，并与改变的胎盘-脑轴可能参与PE相关神经损伤的观点一致。然而，这些观察基于具有固有局限性的体外系统，需要在更复杂的方法学和体内模型中进一步验证。
