综述：细胞外囊泡作为ARDS肺内皮功能障碍的驱动因素：机制与治疗机遇

《Comprehensive Physiology》：Extracellular Vesicles as Drivers of Lung Endothelial Dysfunction in ARDS: Mechanisms and Therapeutic Opportunities

　　

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种复杂的、危及生命的疾病，可由直接肺部损伤（如肺炎和误吸）以及间接肺外原因（包括脓毒症和创伤）引发。ARDS发病机制的一个关键驱动因素是肺内皮屏障的破坏。在过去的几十年里，广泛的研究已经阐明了在ARDS期间发生的急性肺损伤（ALI）病理生理过程中内皮细胞（EC）功能障碍的众多机制。研究人员已鉴定出一系列EC调节因子，以及旨在恢复EC完整性的治疗策略。最近，细胞外囊泡（EVs）已成为ARDS发病机制中的关键介质，作为内皮功能的有效调节因子。EVs源于肺部局部或远处组织，可到达肺血管系统，在那里它们放大炎症信号并破坏EC屏障完整性，从而加剧损伤和疾病严重程度。本综述总结了关于来自不同细胞、组织和器官来源的EVs如何导致ALI病理生理学中内皮功能障碍的最新进展。它还探讨了新兴的针对内皮的ARDS治疗方法，涵盖临床前和临床阶段，这些方法可能对抗EV介导的致病机制，并强调了仍有待解决的关键空白。

**1 Introduction**
急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种以严重呼吸窘迫、广泛肺部炎症和血氧饱和度降低为特征的临床状况，其发病机制涉及急性肺损伤（ALI）过程，主要由肺泡-毛细血管屏障破坏、中性粒细胞过度浸润和炎性介质释放驱动，最终导致肺水肿。肺内皮屏障是损伤的核心部位，其破坏导致对富含蛋白质的液体通透性增加和炎性细胞过度募集。肺内皮细胞（ECs）具有维持血管完整性、调节液体交换和参与免疫反应等多种功能。在ALI中，ECs被外部刺激（如细菌、病毒或酸）及内部介质（如活性氧（ROS）、凝血酶和细胞因子）驱动进入促炎状态，表现为黏附分子（VCAM-1、ICAM-1和选择素）上调、NF-κB信号激活、氧化应激及促炎细胞因子（如IL-6、IL-8、IL-1β）分泌增强。ALI损伤还触发增加内皮通透性的信号级联反应，通过细胞骨架重组和细胞间连接破坏导致屏障破坏。此外，ECs经历多种形式的程序性和非程序性死亡，进一步损害屏障完整性。细胞外囊泡（EVs）已成为介导细胞间通讯和器官间通讯的重要介质，越来越多的证据表明它们在ALI期间驱动肺内皮功能障碍。

**2 EVs and Their Role in Endothelial Dysfunction in ALI/ARDS**
EVs是由几乎所有细胞类型在生理条件及细胞激活或死亡时释放的脂质双层颗粒，根据大小分为小EVs（<200nm）和大EVs（>200nm）。早期研究按生物起源分类，外泌体属于小EV类别，由多囊泡体（MVBs）与质膜融合释放；微囊泡则直接从质膜出芽。国际细胞外囊泡学会（ISEV）建议使用通用术语“EVs”，除非特定EV群体被严格分离和表征。EVs携带多种货物，包括蛋白质、脂质、RNA（mRNA和miRNA）、DNA甚至线粒体等细胞器，通过自分泌、旁分泌或内分泌/外分泌方式将分子货物转移至靶细胞，介导细胞间和器官间通讯。实验和临床研究表明，EV产生在ALI/ARDS及相关条件中发生改变，来自不同细胞来源和组织的EVs参与肺损伤。由于肺内皮具有战略位置并与循环细胞持续相互作用，它是EV介导效应的首要靶点。

**2.1 Lung Endothelial-Derived EVs**
肺血管内皮在损伤性刺激（包括细菌产物、机械牵张和细胞因子）下产生具有促炎特性的EVs。研究表明，EC（HUVEC）来源的EVs通过递送卵泡抑素样蛋白1（FSTL1）激活受体ECs中的TLR4/JAK3/STAT3/IRF-1信号通路，促进ALI。TNF-α刺激的HUVEC产生的EC-EVs通过携带c-Src破坏内皮细胞间连接，增加通透性。脂多糖（LPS）处理的EC来源的EVs通过转移miR-23b靶向ZO-1，增加体外和体内内皮通透性。EC来源的EVs还可通过间接机制促进屏障破坏，例如富含核转运蛋白亚基β-1（KPNB1）的EVs刺激中性粒细胞上调中性粒细胞弹性蛋白酶（NE），导致中性粒细胞反向跨内皮迁移，这些激活的中性粒细胞通过NE降解EC连接处的连接黏附分子-C（JAM-C），加重肺损伤。

**2.2 Lung Epithelial-Derived EVs**
肺泡上皮细胞在ALI发病机制中起关键作用，感染性和非感染性刺激均可触发具有独特分子货物的上皮EV释放。高氧条件下，肺上皮EVs富含caspase-3，通过ROCK-1信号激活巨噬细胞炎症反应。LPS刺激后，大鼠肺泡上皮细胞来源的EVs携带miR-92a-3p，激活体外和体内巨噬细胞中的NF-κB信号，促进ALI。此外，肺泡上皮细胞暴露于肺炎链球菌的毒力因子肺炎球菌溶血素后，释放富含炎性线粒体成分的EVs，这些EVs被中性粒细胞摄取并调控其功能，同时可能靶向肺内皮，促进血管通透性增加和炎症。来自不同来源（包括肺泡上皮细胞）的富含线粒体成分的EVs可能作为肺内皮炎症和血管功能障碍的重要介质。

**2.3 Immune Cell-Derived EVs**
单核细胞是导致肺EC功能障碍的重要EV来源。LPS处理的THP-1细胞释放携带活性caspase-1和gasdermin D的EVs，被肺微血管EC摄取后导致凋亡，且脓毒症合并ARDS患者中这类EVs水平升高。巨噬细胞-EC串扰在ALI中至关重要，LPS激活的巨噬细胞释放的EVs富含花生四烯酸（AA）代谢物，破坏EC屏障完整性，该效应依赖NFATc3信号。乳酸激活的巨噬细胞释放含HMGB1的EVs，诱导EC激活和连接破坏。巨噬细胞还可释放含SCIMP（SLP65/Csk相互作用膜蛋白）的EVs，作为外周中性粒细胞的趋化因子。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染肺泡巨噬细胞后释放的EVs通过递送TNF-α和miR-146a-5p触发受体巨噬细胞的坏死性凋亡。中性粒细胞激活后释放EVs，其作用存在争议，既有促炎也有抗炎报道。fMLP、LPS或PMA激活的中性粒细胞产生的EVs富含miRNA（miR-142-3p、miR-451），可转移至微血管EC触发凋亡和促炎细胞因子释放。中性粒细胞来源的EVs还可包装活性NE，这些EVs通过Mac-1与胶原纤维结合并降解细胞外基质。

**2.4 Platelet-Derived EVs**
激活的血小板释放大量具有促炎和促凝血特性的EVs。储存血液制品中的血小板来源EVs通过靶向内皮参与输血相关ALI（TRALI）的发病机制。随时间储存的血小板释放增加的EVs富含长链神经酰胺，并耗尽S1P，诱导内皮屏障破坏。凝血酶激活的血小板释放含有miR-223的EVs，直接诱导HUVEC凋亡。LPS触发的血小板EVs通过磷脂酰丝氨酸结合导致内皮屏障破坏，上调炎性细胞因子和黏附分子。登革热感染期间，血小板激活释放富含IL-1β的EVs，增强内皮通透性并刺激EC释放促炎标志物。

**2.5 RBC-Derived EVs**
红细胞（RBC）输血与TRALI发病相关，储存的浓缩RBC（pRBCs）释放EVs，激活肺ECs释放促炎细胞因子（如IL-6和KC）并促进黏附分子（VCAM-1和ICAM-1）脱落。这些EVs通过蛋白激酶C（PKC）依赖性通路刺激肺EC释放P-selectin和血管性血友病因子（vWF）。RBC来源的EVs通过Rab5调节的内吞作用引起肺EC激活。细胞游离血红蛋白（CFH）及其代谢物（如血红素）可直接导致内皮激活和通透性增加，并可作为EV相关分子。

**2.6 EVs Within the Alveolar Space**
在ARDS中，肺泡空间成为来自巨噬细胞、中性粒细胞、单核细胞、血小板、上皮细胞和EC等多种细胞类型EVs的丰富储库。这些肺泡EVs携带炎性介质和miRNAs，靶向下游细胞。LPS处理小鼠的支气管肺泡灌洗液（BAL）EVs携带TNF-α，在肺泡上皮细胞中诱导炎性信号。ARDS患者中，分泌型磷脂酶A2-IIA（sPLA2-IIA）与EVs相关。经鼻内LPS处理小鼠肺泡空间释放的EVs含有大量AA代谢物（前列腺素和HETEs），可直接导致内皮屏障破坏。

**2.7 Circulating EVs**
ARDS可由直接肺源性或间接肺外原因引起，脓毒症是最常见原因。循环EVs来自脓毒症、脑外伤、胰腺炎等，通过不同机制影响肺内皮。脓毒症诱导ARDS患者血浆EVs通过递送miR-210-3p靶向ATG7，导致肺EC炎症和自噬失调。盲肠结扎穿刺（CLP）模型大鼠EVs携带升高的miR-1-3p，靶向SERP1导致EC凋亡、炎症和通透性增加。循环EVs还携带S100A8/A9、mtDNA等分子促进内皮功能障碍。严重脑外伤患者血清EVs含有炎性小体蛋白ASC，触发人肺EC焦亡。急性胰腺炎小鼠模型循环EVs通过整合素与肺内皮相互作用，导致EC连接破坏和促炎信号。肥胖患者EVs携带降低的miR-150-5p，促进VE-cadherin内吞和溶酶体降解，增加内皮通透性。

**2.8 Bacterial EVs**
细菌EVs具有强促炎特性。铜绿假单胞菌EVs导致肺微血管EC屏障破坏，并在低剂量LPS预处理小鼠中诱导肺损伤。大肠杆菌EVs被微血管EC内化，通过NF-κB和TLR4依赖性通路上调黏附分子（ICAM-1、VCAM-1和E-selectin）并刺激IL-8产生。肺炎克雷伯菌EVs通过下调SIRT1加速EC衰老和超氧阴离子生成。致病菌EVs转运毒力因子，如肺炎球菌溶血素、α-溶血素、LPS和脂磷壁酸，这些均是EC损伤的已知驱动因素。总体而言，不同来源的EVs通过共同的内皮损伤通路汇聚，包括破坏内皮连接、降解细胞外基质、上调黏附分子及增强炎性介质释放，促进持续的血管炎症。

**2.8.1 Limitations and Considerations**
大多数关于EVs对内皮功能影响的证据来自体外研究，残留刺激可能混淆实验结果。研究人员采用多种验证策略，如在无血清条件下评估LPS处理细胞来源的EVs活性，或鉴定特定EV货物成分的因果作用。不同分离方案引入异质性，EV制备本质上呈异质性。研究使用了多种EC类型，肺微血管ECs具有特殊屏障功能，而HUVEC等大血管模型可能无法完全再现肺微血管反应。未来研究应解析不同EC亚型中的EV信号。

**3 Emerging Therapeutics That Protect the Endothelial Barrier in ARDS**
鉴于内皮功能障碍在ARDS发病机制中的核心作用，开发内皮靶向治疗具有前景。本节总结临床和临床前阶段的治疗药物，并讨论其潜在的EV介导调节作用。

**3.1 Therapeutics Under Clinical Development**
**eNAMPT—ALT-100**: 胞外烟酰胺磷酸核糖转移酶（eNAMPT）作为损伤相关分子模式（DAMP）激活TLR4，导致EC屏障破坏和促炎信号。ALT-100单克隆抗体正进行2期临床试验（NCT05938036）。eNAMPT可在EVs中释放，NAMPT过表达促进EV释放。**TLR4—Paridiprubart**: 抗TLR4单抗paridiprubart在2期试验中评估（NCT06701669）。TLR4激活触发促炎EV释放，EVs可激活TLR4信号，阻断TLR4可减少有害EV产生。**C5a—Vilobelimab**: 补体C5a促进促炎或促凝血EV释放，抗C5a抗体vilobelimab和STSA-1002正在ARDS临床试验中。**VEGF—Bevacizumab**: VEGF增加血管通透性，抗VEGF抗体bevacizumab在2期试验中（NCT06701656）。VEGF可在EVs中包装，bevacizumab可能无法中和EV包裹的VEGF。**Syk—Fostamatinib**: Syk抑制剂fostamatinib在2期试验中（NCT06564207），其活性代谢物R406降低激活RBC和血小板的EV产生。**p38:MK2—GEn-1124**: GEn-1124抑制p38:MK2复合物，在2期试验中（NCT05795465），EVs可激活p38信号。**NE—Sivelestat**: 中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂sivelestat在脓毒症和ARDS临床试验中，NE丰富的EVs降解细胞外基质，sivelestat可能抑制EV相关NE的效应。**IL-1R—Anakinra**: IL-1受体拮抗剂anakinra在2期试验中（NCT05914454），IL-1β触发EV释放，EVs携带IL-1β，anakinra可阻断IL-1R信号。**Tie2/Ang—AV-001**: 血管生成素-1（Ang-1）模拟肽AV-001在2a期试验中（NCT05123755），EVs携带Ang-2和Ang-1。**CD14—IC14**: 抗CD14抗体IC14在2期试验中（NCT06513949），CD14⁺ EVs在脓毒症ARDS患者BAL中升高。**cAMP Modulators—Iloprost**: 前列环素类似物iloprost正在试验中，cAMP调节剂减少炎性EV产生，如ensifentrine预处理肺泡上皮细胞可减弱EV释放及其屏障破坏效应。**ENaC—Solnatide**: ENaC激活肽solnatide（AP301）在2b期试验中，ENaC可被EVs携带和激活。**MSC-Derived EVs—ExoFlo**: 骨髓间充质干细胞来源EVs在3期试验中（NCT05354141），通过传递功能性线粒体恢复EC功能。

**3.2 Emerging Therapeutics in Pre-Clinical Development**
**S1P/S1PR**: S1P类似物（如Tysiponate）增强EC屏障功能。EVs可作为S1P来源，S1P类似物如fingolimod改变循环EV水平和功能。**HMGB1**: HMGB1包装在EVs中，巨噬细胞通过EVs释放HMGB1激活炎性小体。**TRPV4**: TRPV4抑制可能中断EV介导的钙信号。激活血小板释放的EVs可触发血管平滑肌细胞TRPV4。**Cell-Free Hemoglobin**: CFH包装在EVs中，CFH靶向治疗可能影响EV释放和功能。

**3.3 Limitations and Considerations**
治疗策略包括小分子和生物制剂，各有优缺点。单克隆抗体适合阻断EV与靶细胞相互作用，小分子可能更有效抑制EV生物发生和改变货物组成。ARDS的异质性（病因和亚表型）影响治疗反应，EV丰度、来源和效应可能因亚表型而异，整合EV谱与亚表型分析对精准靶向至关重要。

**4 Conclusion**
肺内皮是ARDS损伤的关键部位，EVs来自局部和远处细胞组织，通过共同通路加剧屏障破坏。深入理解EV介导的内皮功能障碍机制对于开发保护内皮完整性、减轻肺损伤的靶向策略至关重要。