《CNS Neuroscience & Therapeutics》：DL-3-n-Butylphthalide Protects Against PrP106?126-Induced Neurotoxicity Through NRF2 Signaling and OPA1/DRP1-Mediated Mitochondrial Dynamics
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背景：朊病毒疾病(prion diseases)是由错误折叠的朊蛋白引起的致命性神经退行性疾病。DL-3-正丁基苯酞(NBP)是一种合成化合物，来源于芹菜籽，在多种神经系统疾病中显示出神经保护作用。然而，其对朊病毒肽诱导的神经毒性的作用尚不清楚。
方法：在N2
背景：朊病毒疾病(prion diseases)是由错误折叠的朊蛋白引起的致命性神经退行性疾病。DL-3-正丁基苯酞(NBP)是一种合成化合物，来源于芹菜籽，在多种神经系统疾病中显示出神经保护作用。然而，其对朊病毒肽诱导的神经毒性的作用尚不清楚。
方法：在N2a细胞中建立PrP106-126诱导的神经毒性模型，以评估NBP的作用。研究人员检测了NBP预处理后的细胞凋亡、氧化应激、线粒体功能、线粒体动力学和呼吸链完整性。通过OPA1敲低(knockdown)、DRP1过表达(overexpression)、NRF2抑制(inhibition)和NRF2过表达来检查机制因果性。关键发现在人类iPSC来源的神经元中进一步验证。
结果：NBP减轻了PrP106-126诱导的神经元凋亡，减少了细胞色素c释放和caspase 3切割。NBP还通过降低活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)水平、恢复总抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)活性、增强NRF2/HO-1信号通路来缓解氧化应激。同时，NBP通过维持线粒体膜电位(MMP)、三磷酸腺苷(ATP)产生、耗氧率(OCR)和线粒体DNA(mtDNA)含量，以及维持呼吸链复合物的表达和活性，保护了线粒体完整性和生物能量学。NBP进一步使线粒体动力学正常化，恢复了OPA1水平并减少了线粒体组分中DRP1的富集。在功能上，OPA1敲低、DRP1过表达或NRF2抑制消除了NBP介导的保护作用，而NRF2过表达重现了关键保护效应并使OPA1/DRP1相关标志物正常化。在人类iPSC来源的神经元中观察到一致的保护趋势。
结论：NBP通过激活NRF2依赖性抗氧化信号和维持线粒体稳态来减轻PrP106-126诱导的神经毒性，并伴有OPA1/DRP1相关线粒体动力学的正常化。这些发现支持在朊病毒疾病相关模型中进一步评估NBP。
**研究背景、问题与研究目的**
朊病毒疾病（prion diseases）是一类由宿主编码的细胞型朊蛋白（PrP
C）错误折叠为致病性异构体（PrP
Sc）所引发的致死性神经退行性疾病，涉及人类及多种动物。由于病原体仅由蛋白质构成、且缺乏可靠的早期诊断标志物，该病的治疗进展极为有限，目前尚无有效方法可阻止或逆转病程。近年来的研究证据表明，氧化还原失衡（redox imbalance）和线粒体损伤（mitochondrial impairment）是朊病毒相关神经毒性及其他神经退行性疾病（如阿尔茨海默病和帕金森病）的共性病理特征。研究人员前期的研究发现，朊病毒肽（prion peptide）诱导的神经毒性紧密关联于线粒体功能障碍，包括线粒体膜电位（MMP）去极化、ATP耗竭及线粒体动力学（mitochondrial dynamics）失调。这些变化部分受动力相关蛋白1（DRP1）和视神经萎缩蛋白1（OPA1）的协同调控；OPA1/DRP1轴的失衡可促进过度线粒体碎片化、生物能量衰竭和线粒体依赖性凋亡信号。同时，朊病毒肽可升高活性氧（ROS）产生并削弱抗氧化防御，加剧氧化损伤和神经元丢失。因此，恢复线粒体动力学和氧化还原稳态可能为朊病毒相关神经退变提供治疗思路。
DL-3-正丁基苯酞（NBP）是一种从芹菜籽中衍生的合成小分子，在中国已被批准用于治疗缺血性脑卒中。临床前研究表明，NBP在阿尔茨海默病、帕金森病及其他神经疾病模型中通过减轻氧化应激、保护线粒体生物能量学和减少凋亡来发挥神经保护作用。机制上，NBP可激活抗氧化防御通路，特别是NRF2/HO-1轴。然而，目前尚不明确NRF2依赖性抗氧化信号是否将NBP与恢复OPA1/DRP1介导的线粒体动力学和功能联系起来，尤其是在朊病毒肽诱导的神经毒性背景下。因此，本研究旨在探讨NBP是否能通过恢复线粒体功能和氧化还原平衡来减轻PrP106-126诱导的神经毒性，重点关注NRF2/HO-1信号通路及调控线粒体动力学的OPA1/DRP1轴。同时，通过NRF2抑制（ML385）和过表达、OPA1敲低和DRP1过表达实验验证机制因果性，并在人类iPSC来源的神经元中进行关键发现验证，以增强转化医学相关性。
本研究论文发表在《CNS Neuroscience》期刊。
**主要关键技术与方法**
本研究采用小鼠N2a神经母细胞瘤细胞系（ATCC, CCL-131）和人类iPSC来源神经元（DYR0100, ATCC）作为实验模型。关键方法包括：使用合成朊病毒蛋白片段PrP106-126（100 μM）处理24 h建立神经毒性模型，NBP（10 μM）预处理24 h；通过CCK-8和TUNEL染色检测细胞活力和凋亡；利用Western blot分析细胞色素c、cleaved caspase 3、NRF2、HO-1、呼吸链复合物亚基（NDUFB8、SDHB、UQCRC1、MTCO2、ATP5A1）及OPA1和DRP1的蛋白表达；采用DCFH-DA、TMRE、ATP检测试剂盒及OCR试剂盒分别测定ROS、MMP、ATP水平和耗氧率；使用相关试剂盒检测MDA、T-AOC、SOD活性及呼吸链复合物I–IV酶活性；通过qPCR定量mtDNA拷贝数；利用透射电镜观察线粒体超微结构；通过Mito-GFP质粒转染配合共聚焦显微镜分析线粒体形态；使用siRNA敲低OPA1、PCMV-HA-DRP1质粒过表达DRP1及PCMV-HA-NRF2质粒过表达NRF2，结合ML385抑制NRF2，进行机制验证。
**研究结果**
**3.1 NBP抑制PrP106-126诱导的N2a细胞凋亡**
通过CCK-8和TUNEL实验发现，NBP预处理可显著提高PrP106-126暴露后N2a细胞的存活率并减少凋亡细胞比例。Western blot结果显示，NBP抑制了线粒体细胞色素c向胞质释放并减少了cleaved caspase 3水平，表明NBP通过抑制线粒体依赖性凋亡信号发挥保护作用。
**3.2 NBP减轻PrP106-126诱导的N2a细胞氧化应激**
ROS和MDA水平升高、T-AOC和SOD活性降低被NBP预处理逆转。Western blot显示，NBP恢复了PrP106-126降低的NRF2和HO-1蛋白表达，提示NBP通过激活NRF2通路来重建立氧化还原平衡。
**3.3 NBP缓解PrP106-126诱导的N2a细胞线粒体功能障碍**
共聚焦显微镜和TEM显示，PrP106-126引起线粒体碎片化和嵴结构破坏，NBP预处理保留了线粒体网络完整性、增加了线粒体长度、降低了碎片化比例、恢复了嵴数。功能上，NBP逆转了PrP106-126引起的MMP下降、OCR降低、ATP减少和mtDNA含量下降。
**3.4 NBP改善PrP106-126诱导的呼吸链损伤**
Western blot和酶活性检测表明，PrP106-126降低了呼吸链复合物I–V亚基（NDUFB8、SDHB、UQCRC1、MTCO2、ATP5A1）的蛋白表达及复合物I–IV的酶活性；NBP预处理维持了这些表达和活性。
**3.5 NBP通过调控OPA1和DRP1改善线粒体动力学**
Western blot结果显示，PrP106-126降低了细胞总OPA1水平并增加了线粒体组分中的DRP1富集；NBP预处理恢复了OPA1表达并减少了线粒体DRP1积累，提示NBP促进了融合/分裂平衡。
**3.6 OPA1敲低或DRP1过表达消除NBP介导的神经保护**
OPA1敲低后，NBP无法恢复MMP、ATP和ROS水平，细胞活力和抗凋亡作用消失。DRP1过表达同样消除了NBP的保护效应。这些结果表明，OPA1介导的融合和DRP1驱动的分裂调节是NBP神经保护的必要条件。
**3.7 NBP通过NRF2通路发挥神经保护作用**
使用ML385抑制NRF2后，NBP对HO-1诱导、OPA1恢复及DRP1富集减少的作用被削弱，MMP、ATP和ROS的恢复也丧失。相反，NRF2过表达模拟了NBP的部分保护作用，包括诱导HO-1、恢复OPA1/DRP1轴、改善MMP和ATP、降低ROS。这表明NRF2是NBP保护作用的上游调控因子。
**3.8 NBP在人类iPSC来源神经元中减轻PrP106-126诱导的线粒体功能障碍和氧化应激**
在人类神经元中，PrP106-126同样导致MMP和ATP降低、ROS升高、NRF2/HO-1减少、OPA1下降及线粒体DRP1增加。NBP处理逆转了这些改变，验证了关键发现的转化相关性。
**总结讨论**
本研究证实，NBP在PrP106-126诱导的神经毒性模型中通过激活NRF2依赖性抗氧化信号、进而正常化OPA1/DRP1相关线粒体动力学，有效保护线粒体功能并减少凋亡。OPA1敲低、DRP1过表达或NRF2抑制均消除NBP的保护作用，而NRF2过表达重现保护效果，提供了因果证据。在人类iPSC来源神经元中的验证进一步增强了转化潜力。与其他研究相比，NBP调节线粒体动力学的机制因病理模型而异，本研究首次在朊病毒肽毒性中揭示了NRF2-OPA1/DRP1轴的作用。尽管存在使用体外模型和缺乏感染性朊病毒模型的局限性，但NBP已在中国获批用于缺血性脑卒中，为其在朊病毒疾病中的重定位提供了可行性基础。
**结论翻译**
本研究确定NBP是针对PrP106-126诱导神经毒性的有效神经保护剂。通过激活NRF2依赖性抗氧化信号并随后正常化OPA1/DRP1相关线粒体动力学，NBP保护了线粒体生物能量学、减少了氧化损伤并限制了线粒体依赖性凋亡细胞死亡。鉴于NBP已在中国获批用于缺血性脑卒中，其现有的临床使用支持其重定位的潜力，但尚需在朊病毒疾病模型中进一步验证。本研究的发现为未来在可行的条件下对NBP在朊病毒感染动物模型中进行临床前评估提供了理论基础。
