上调的PKM2通过Nrf2反式激活保护多巴胺能神经元免受氧化损伤：在MPTP诱导的帕金森病小鼠模型中的研究

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Upregulated PKM2 Protects Dopaminergic Neurons From Oxidative Damage Through Nrf2 Transactivation in an MPTP-Induced Mouse Model of Parkinson's Disease

　　

背景：黑质致密部（SNc）多巴胺能神经元的死亡是帕金森病（PD）的核心病理改变。研究人员先前表明，减少神经元丙酮酸激酶M2（PKM2）会加重氧化损伤并加速多巴胺能神经元丢失，但其机制尚不清楚。方法：在MPTP小鼠模型中，研究人员评估了选择性删除多巴胺能神经元中PKM2或过表达PKM2后的抗氧化反应和神经元存活。在MPP⁺处理的原代神经元中，研究人员检测了活性氧（ROS）如何影响hnRNP A1/A2及PKM2的替代剪接，并通过敲低hnRNP A1/A2或清除ROS测试了可逆性。结果：神经元PKM2敲低消除了MPTP诱导的Nrf2靶基因激活，加剧了脂质过氧化和DNA损伤，并加速了多巴胺能神经元丢失，而PKM2过表达则恢复了抗氧化反应并减轻了神经退行性变。机制上，MPP⁺产生的ROS增加了hnRNP A1/A2，促进了向PKM2的替代剪接并提高了其丰度；相反，敲低hnRNP A1/A2或清除ROS逆转了该剪接转换并减弱了抗氧化反应。结论：这些发现描绘了一条信号通路，其中ROS升高hnRNP A1/A2，有利于PKM2产生，并激活Nrf2，从而为PKM2缺失时观察到的氧化损伤和进行性多巴胺能神经元退变提供了机制基础。因此，PKM2–Nrf2轴成为PD疾病修饰治疗的候选靶点。

论文解读文章

帕金森病（PD）是第二常见的神经退行性疾病，其核心病理特征为黑质致密部（SNc）多巴胺能神经元的进行性退变和路易小体的广泛积累。遗传突变（如SNCA、LRRK2、DJ-1、Parkin、PINK1）和环境毒素（如MPTP、鱼藤酮、百草枯）通过损害线粒体功能产生活性氧（ROS），而多巴胺能神经元因长无髓鞘轴突和大量突触对氧化损伤尤为脆弱。核因子E2相关因子2（Nrf2）是细胞氧化应激反应的核心调控因子，激活后可启动谷胱甘肽合成、脂质过氧化物中和及ROS清除相关基因（如GPX4、PRDX1）的转录。研究表明，PD患者SNc多巴胺能神经元中Nrf2核积累增加，提示代偿性抗氧化增强。丙酮酸激酶M2（PKM2）不仅是糖酵解限速酶，还可作为蛋白激酶和转录共激活因子参与神经退行性疾病。研究人员前期发现，减少神经元PKM2加重氧化损伤并加速多巴胺能神经元退变，但机制不明。因此，本研究旨在验证神经元PKM2是否通过激活Nrf2及其抗氧化程序保护神经元的假说，并解析上游调控机制。该论文发表在《CNS Neuroscience》。

研究人员为开展本研究采用的主要关键技术方法包括：使用雄性C57BL/6J小鼠及PKM2^flox/flox小鼠（由Prof. Ke Zen提供），通过AAV-TH-Cre或AAV-TH-PKM2立体定位微注射实现SNc区多巴胺能神经元特异性PKM2敲低或过表达，并用MPTP（20 mg/kg）皮下注射建立亚急性PD模型；原代神经元培养及MPP⁺处理；采用酪胺信号放大（TSA）多光谱染色、免疫组化、免疫荧光、免疫印迹、蓝绿温和胶（BNP）检测PKM2构象；通过qRT-PCR和限制性酶切PCR分析PKM剪接；利用染色质免疫沉淀（ChIP）评估Nrf2与靶基因启动子结合；使用慢病毒shRNA敲低hnRNP A1/A2，并用N-乙酰半胱氨酸（NAC）清除ROS。

研究结果部分：

3.1 多巴胺能神经元特异性PKM2缺失损害MPTP诱导PD模型中的Nrf2激活。通过Co-IP证实PKM2与Nrf2存在内源性互作；在PKM2^flox/flox小鼠中，AAV-TH-Cre微注射实现PKM2敲低后，MPTP刺激下TH阳性神经元中Nrf2靶基因PRDX1和GPX4的蛋白水平升高被消除，表明PKM2是Nrf2激活所必需的。

3.2 多巴胺能神经元特异性PKM2缺失加剧MPTP诱导PD模型中的神经元氧化应激和丢失。PKM2缺失导致TH阳性神经元中脂质过氧化产物4-HNE和DNA双链断裂标志物γ-H2AX积累增加，并加重MPTP诱导的多巴胺能神经元丢失。此外，PKM2敲低不影响NF-κB下游SOD2，但降低p53靶基因TIGAR表达，提示除Nrf2外，PKM2还可通过p53–TIGAR轴提供补充保护。

3.3 过表达PKM2通过Nrf2反式激活挽救MPTP诱导PD模型中的多巴胺能神经元丢失。MPTP模型中TH阳性神经元PKM2蛋白水平显著升高，MPP⁺处理原代神经元中亦如此。过表达PKM2（主要呈二聚体形式）上调了PRDX1和GPX4的表达，并显著增加多个经典Nrf2靶基因（NQO1、HO-1、G6PDH、GCLC、GCLM、GPX2、GSR1、GSTA1）的mRNA水平。ChIP实验显示PKM2过表达增强Nrf2与PRDX1和GPX4启动子的结合，但不改变Nrf2核转位或总蛋白水平。过表达PKM2显著减少MPTP诱导的TH阳性神经元丢失。在胶质细胞中，MPP⁺不改变PKM2水平，但PKM2敲低同样抑制Nrf2靶基因诱导，表明该调控非细胞类型特异。

3.4 MPP⁺通过上调hnRNP A1/A2加速PKM替代剪接。MPTP/MPP⁺处理不改变总PKM蛋白，但下调PKM1、上调PKM2。限制性酶切和PCR证实MPP⁺促进PKM外显子10包含（PKM2）而抑制外显子9（PKM1）。hnRNP A1/A2在MPP⁺处理的原代神经元和MPTP小鼠TH阳性神经元中表达升高；敲低hnRNP A1/A2减少MPP⁺诱导的PKM剪接转换。

3.5 敲低hnRNP A1/A2通过抑制Nrf2激活加剧神经元死亡。敲低hnRNP A1/A2阻止MPP⁺诱导的PRDX1和GPX4蛋白升高，增加4-HNE和γ-H2AX积累，并进一步缩短神经元突起长度。

3.6 MPP⁺通过诱导ROS上调hnRNP A1/A2表达。使用ROS清除剂NAC预处理后，hnRNP A1/A2蛋白水平显著降低，伴随PKM1上调和PKM2下调，且Nrf2靶基因PRDX1和GPX4的诱导被抑制。

讨论部分总结了研究结论：在PD病理条件下，MPTP/MPP⁺产生的ROS上调hnRNP A1/A2，促进PKM替代剪接向PKM2转变，PKM2主要呈二聚体形式作为转录共激活因子与Nrf2直接互作，增强Nrf2与靶基因启动子结合，激活抗氧化和谷胱甘肽（GSH）合成通路，从而保护多巴胺能神经元免受氧化损伤。该PKM2–Nrf2轴独立于Nrf2核转位，且可与p53–TIGAR通路协同。此外，PKM1向PKM2的转换降低糖酵解活性，可能将葡萄糖代谢转向磷酸戊糖途径（PPP），为GSH还原提供NADPH，形成代谢-抗氧化协同。这一通路可能干预α-突触核蛋白聚集和LRRK2驱动的ROS恶性循环，成为PD疾病修饰治疗的候选靶点。

研究结论部分翻译总结：研究人员发现，在MPTP诱导的PD小鼠模型中，多巴胺能神经元中PKM2显著上调。该上调机制由MPTP/MPP⁺产生的ROS升高PKM替代剪接调控因子hnRNP A1和hnRNP A2水平，从而促进PKM替代剪接，导致PKM1下调和PKM2上调。多巴胺能神经元中PKM2的上调转录激活Nrf2，增强其靶基因PRDX1和GPX4的表达，从而抵抗氧化损伤并在PD中发挥神经保护作用。