安第斯羽扇豆（Lupinus mutabilis Sweet）蛋白与酪蛋白在INFOGEST体外胃肠模型下的铁螯合活性：肽鉴定、分子对接及合成

《Journal of Functional Foods》：Iron-chelating activity of Andean Lupinus mutabilis Sweet protein and casein under the INFOGEST in vitro gastrointestinal model: peptide identification, molecular docking, and synthesis

　　

主要由膳食铁缺乏引起的贫血被认为是全球公共卫生问题。本地作物多样性可能作为新型铁递送系统（如铁螯合肽）的来源，这些肽也可在高蛋白食物摄入过程中产生。本研究首次评估了安第斯羽扇豆（Lupinus mutabilis Sweet）蛋白与酪蛋白在INFOGEST体外胃肠消化模型下的铁螯合活性。根据蛋白质类型，可溶性蛋白含量、水解度（DH）以及胃相和肠相的铁螯合活性呈现不同趋势。研究人员的L. mutabilis胃肠水解物显示出比酪蛋白水解物更高的水解度（DH）和铁螯合活性。通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）在酪蛋白水解物中鉴定出11种肽，并与酪蛋白中发现的肽匹配。对于L. mutabilis蛋白水解物，从31种从头鉴定的肽中，只有5种与来自L. angustifolius的α-2伴球蛋白（α-2 conglutin）和α-伴球蛋白（α-conglutin）的氨基酸序列匹配。分子对接分析（针对5种L. mutabilis肽和11种酪蛋白肽进行评估）估计两种蛋白质的肽与铁的理论亲和力较低。然而，5种肽（来自L. mutabilis蛋白水解物的EEEEEEPR、EEEEEDEPR、NQLDPSPR和LDPNPR，以及来自酪蛋白水解物的YQQKPV）显示出一定的铁结合分子潜力，并进一步被合成。L. mutabilis肽EEEEEDEPR和EEEEEEPR表现出比酪蛋白肽YQQKPV更高的铁螯合活性（0.393–0.417 μg Fe²⁺/mg肽 vs 0.248 μg Fe²⁺/mg肽），表明L. mutabilis蛋白在胃肠消化后具有生成铁螯合活性肽的潜力。本研究为未来旨在验证当前结果和评估铁生物利用度的体内研究提供了分子和生化基础。

缺铁性贫血是全球公共卫生问题，传统铁补充剂（如硫酸亚铁）生物利用度低（约10%–20%）且存在胃肠道副作用。肽-铁复合物成为一种有前景的替代方案。安第斯羽扇豆（Lupinus mutabilis Sweet）蛋白富含谷氨酸和天冬氨酸，具有铁螯合潜力，但相关研究有限。本研究首次利用INFOGEST 2.0体外胃肠消化模型比较L. mutabilis蛋白与酪蛋白的铁螯合活性，鉴定潜在肽段，并通过分子对接和合成验证其机制。结果表明，L. mutabilis蛋白水解物在水解度和铁螯合活性上优于酪蛋白，合成的多肽EEEEEDEPR和EEEEEEPR表现出较高活性，为该蛋白作为功能性食品成分用于改善铁营养提供了基础。该论文发表在《Journal of Functional Foods》。

研究人员开展的研究使用了以下关键技术方法：L. mutabilis种子来自秘鲁拉莫利纳国立农业大学“豆类及油料作物项目”，酪蛋白购自Sigma-Aldrich（美国）。采用INFOGEST 2.0静态体外胃肠消化模型（修改版，未使用唾液淀粉酶和胃脂肪酶），在胃相和肠相不同时间点（0–120 min）取样。可溶性蛋白含量采用Lowry法测定，水解度（DH）采用TNBS法计算，铁螯合活性采用ferrozine法评估。肽鉴定通过LC-MS/MS（EVOSEP 60 SPD方法，Zenotof质谱仪）进行，数据经Progenesis QI处理，利用Novor软件进行数据库搜索和从头测序（de novo sequencing）。分子对接分析使用AutoDock 4，以Fe²⁺和Fe³⁺为配体，评估结合自由能和空间距离。最有潜力的肽通过Fmoc/tBu固相合成法合成，并经HPLC和ESI-MS纯化与鉴定。

3.1 可溶性蛋白含量和水解度（DH）在INFOGEST体外胃肠消化过程中的变化：通过Lowry法和TNBS法测定。胃相中，L. mutabilis蛋白的可溶性蛋白含量几乎恒定（6.25–7.87 mg/mL），而酪蛋白逐渐增加（1.49–5.44 mg/mL）。DH方面，酪蛋白胃相DH（2.67%）高于L. mutabilis（1.04%）。肠相中，L. mutabilis蛋白DH从5.76%显著增至32.81%，酪蛋白从3.38%增至18.61%，表明L. mutabilis蛋白更易被肠蛋白酶水解。

3.2 L. mutabilis和酪蛋白水解物在INFOGEST胃肠消化过程中的铁螯合活性：采用ferrozine法测定。胃相水解物铁螯合活性低（L. mutabilis为2.97–4.10 μg Fe²⁺/mg蛋白，酪蛋白为0.07–0.22 μg Fe²⁺/mg蛋白），肠相活性显著升高。L. mutabilis蛋白水解物的铁螯合活性波动较大（24.26–48.84 μg Fe²⁺/mg蛋白），酪蛋白则相对稳定（22.98–34.92 μg Fe²⁺/mg蛋白）。L. mutabilis蛋白水解物整体活性高于酪蛋白。此外，未水解的L. mutabilis蛋白也显示活性，可能归因于残留的非蛋白化合物（如单宁、植酸）。

3.3 通过LC-MS/MS从L. mutabilis蛋白和酪蛋白INFOGEST水解物中鉴定肽：L. mutabilis水解物中鉴定出31个从头测序肽，其中5个匹配到L. angustifolius的α-2伴球蛋白和α-伴球蛋白序列，分子量902–1160 Da，富含谷氨酸、天冬氨酸和脯氨酸。酪蛋白水解物中鉴定出11个肽（6个来自β-酪蛋白，4个来自α-s1-酪蛋白，1个来自κ-酪蛋白），分子量551–1088 Da，富含脯氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸（Pro-Phe-Pro）疏水序列。

3.4 分子对接分析：利用AutoDock 4评估5种L. mutabilis肽和11种酪蛋白肽与Fe²⁺/Fe³⁺的相互作用。所有肽的结合能极低（-0.27至-0.67 kcal/mol），表明未形成稳定配位复合物。但部分肽表现出较近的空间距离：YQQKPV的Fe²⁺距Val6末端氧约3.9 ?；NQLDPSPR和LDPNPR的Fe²⁺距脯氨酸残基约3.2–3.3 ?；酸性肽EEEEEDEPR和EEEEEEPR中Fe²⁺距负电荷区约5.2–7.6 ?。这些结构特征被定义为“分子潜力”。

3.5 合成肽的铁螯合活性分析：基于分子对接结果，合成并测定了EEEEEEPR、EEEEEDEPR、NQLDPSPR、LDPNPR（来自L. mutabilis）和YQQKPV（来自酪蛋白）的铁螯合活性。EEEEEEPR活性最高（0.417 ± 0.007 μg Fe²⁺/mg肽），其次为EEEEEDEPR（0.393 ± 0.006 μg Fe²⁺/mg肽），NQLDPSPR（0.248 ± 0.012 μg Fe²⁺/mg肽）和YQQKPV（0.248 ± 0.005 μg Fe²⁺/mg肽）相当，LDPNPR最低（0.017 ± 0.001 μg Fe²⁺/mg肽）。这表明L. mutabilis肽（尤其是酸性肽）具有更好的铁螯合潜力。

总结讨论部分：分子对接结果显示低亲和力，但结构分析提示酸性残基簇和脯氨酸区域可能介导弱静电吸引。实验数据验证了EEEEEDEPR和EEEEEEPR的高活性，且这些肽也出现在其他豆类（如蚕豆）的铁螯合肽研究中。L. mutabilis蛋白水解物中此类肽的丰富程度可能解释了其整体更高的铁螯合活性。未来需通过细胞模型和动物实验验证铁生物利用度。

结论翻译如下：本研究首次利用INFOGEST体外胃肠消化模型评估了L. mutabilis蛋白与酪蛋白的铁螯合活性。可溶性蛋白含量、水解度（DH）和铁螯合活性在不同蛋白质类型和消化阶段呈现不同趋势。L. mutabilis蛋白水解物在胃肠消化后具有更高的水解度和铁螯合活性。通过LC-MS/MS鉴定出5种L. mutabilis肽（与L. angustifolius的α-2伴球蛋白和α-伴球蛋白匹配）和11种酪蛋白肽。分子对接分析估计L. mutabilis和酪蛋白肽与铁的理论亲和力较低，但其中4种L. mutabilis肽（EEEEEEPR、EEEEEDEPR、NQLDPSPR和LDPNPR）和1种酪蛋白肽（YQQKPV）显示出潜在铁相互作用的结构特征。此外，合成的L. mutabilis肽EEEEEDEPR和EEEEEEPR表现出比酪蛋白肽YQQKPV更高的铁螯合活性（0.393–0.417 μg Fe²⁺/mg肽 vs 0.248 μg Fe²⁺/mg肽），表明L. mutabilis蛋白在体外胃肠消化后具有生成铁螯合活性肽的潜力。本研究首次使用标准化体外胃肠消化模型揭示了L. mutabilis肽的铁螯合潜力，并与参考蛋白酪蛋白进行比较，同时整合了理论和体外平台以理解结构-功能关系。未来研究应聚焦于验证这些肽在生理条件下的铁螯合活性、生物利用度和稳定性，以及它们在细胞和体内模型中增强铁吸收的能力。此外，将这些肽纳入功能性食品或营养品中，有望改善铁营养和预防缺铁。