高植物甾醇菜籽油通过改善内皮细胞及单核细胞-巨噬细胞分化中的氧化应激与炎症损伤预防动脉粥样硬化

《Journal of Future Foods》：High-phytosterol rapeseed oil prevents atherosclerosis by ameliorating damage of oxidative stress and inflammation in endothelial cells and monocyte-macrophage differentiation

　　

全球范围内存在大量动脉粥样硬化（AS）患者，而高植物甾醇菜籽油（HPRO）可能具有显著改善该疾病的潜力。本研究考察了HPRO的抗动脉粥样硬化作用，以及β-谷甾醇通过降低人主动脉内皮细胞（HAEC）和单核细胞-巨噬细胞中的氧化应激与炎症而缓解AS的潜在机制。结果表明，HPRO可降低小鼠AS病变严重程度并减少活性氧（ROS）水平；β-谷甾醇通过调控KLF4/Nrf2/HO-1/ROS和MAPK/PPARγ通路，减轻HAEC中的氧化损伤与炎症。β-谷甾醇在单核细胞向巨噬细胞分化过程中，通过阻断NADPH氧化酶（NADPH oxidase）/ROS信号通路抑制基质穿透，并通过TLR4/MyD88/TRAF6/TNF-α通路降低炎症。综上，β-谷甾醇可能通过保护内皮细胞及单核细胞-巨噬细胞免受氧化应激和炎症损伤而发挥作用，从而为HPRO在AS预防中的应用与推广奠定理论基础。

该研究发表于《Journal of Future Foods》，围绕高植物甾醇菜籽油（HPRO）及其主要活性成分β-谷甾醇对动脉粥样硬化（AS）的干预作用展开，重点解析其对血管内皮损伤、单核细胞-巨噬细胞分化、氧化应激与炎症反应的调控机制。研究背景在于，AS是全球心血管死亡的主要病理基础，其发生发展与血管内皮细胞功能障碍、巨噬细胞聚集、脂质沉积、氧化应激增强和慢性炎症持续激活密切相关。尽管植物甾醇被认为具有调脂和心血管保护潜力，且菜籽油是其重要膳食来源，但高植物甾醇菜籽油是否能够系统性缓解AS，以及其是否通过内皮细胞和单核细胞-巨噬细胞相关通路发挥保护效应，仍缺乏充分证据。因此，研究人员开展本研究，旨在从整体动物水平和细胞机制水平验证HPRO的抗AS效应，并明确β-谷甾醇的关键分子作用轴。

从研究设计看，研究人员以ApoE^?/?小鼠西方饮食模型评估HPRO对AS表型的改善作用，并结合人主动脉内皮细胞（HAEC）H₂O₂氧化损伤模型、PMA诱导的THP-1单核细胞分化模型以及LPS诱导的巨噬细胞炎症模型，系统考察β-谷甾醇的作用。结果显示，HPRO能够减轻主动脉病变、降低氧化应激、改善外周免疫异常与动脉僵硬；β-谷甾醇则在细胞层面同时抑制内皮损伤和单核细胞-巨噬细胞炎症活化。论文的重要意义在于，研究不仅验证了高植物甾醇菜籽油作为功能性食用油在AS预防中的潜在应用价值，还进一步从KLF4/Nrf2/HO-1、MAPK/PPARγ、NADPH oxidase/ROS及TLR4/MyD88/TRAF6/TNF-α等多条信号通路层面，建立了β-谷甾醇多靶点协同抗AS的理论框架。

研究采用的主要技术方法包括：以6周龄雄性ApoE^?/?小鼠和C57BL/6J小鼠构建膳食干预模型，并通过颈动脉脉搏波传导速度（PWV）检测、血清生化分析、主动脉组织染色和流式细胞术评价病变程度；在HAEC中应用CCK-8、EdU、划痕、Transwell、β-gal、H&E、Hoechst 33258、MDC/PI、JC-1、透射电镜、免疫荧光、氧化与炎症指标检测以及Western blot和siRNA干扰分析氧化损伤机制；在THP-1体系中利用PMA诱导分化、明胶酶谱、流式细胞术、RT-qPCR、Western blot和分子对接分析单核细胞分化、基质侵袭及炎症信号调控。动物样本来源为ApoE^?/?小鼠与C57BL/6J小鼠。

在研究结果部分，论文首先在“3.1. HPRO ameliorates AS-related indexes in mice”中说明，HPRO可改善AS小鼠整体病理指标。在“3.1.1. HPRO ameliorates aortic lesion conditions”中，研究人员通过主动脉原位观察、扫描电子显微镜（SEM）、免疫荧光和流式细胞术发现，西方饮食组主动脉内皮表面粗糙、血栓面积增大、紧密连接减少、细胞间隙增宽，而HPRO干预后主动脉结构损伤减轻。与此同时，主动脉内CD68和ET-1表达降低，提示巨噬细胞聚集和内皮功能障碍得到缓解；主动脉ROS水平下降，提示氧化应激减弱；PWV下降，提示动脉僵硬度改善。因此，该部分证明HPRO能够从组织结构、炎症浸润、氧化损伤和血管功能多个层面减轻AS病变。

在“3.1.2. HPRO ameliorates abnormal serum biochemical indicators and peripheral blood immune conditions”中，研究人员进一步表明，HPRO可改善血脂谱并降低血清单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）水平，同时下调外周血CD11b、Ly-6C和Ly-6G等免疫相关标志物。该结果说明，HPRO不仅改善局部血管病变，也可缓解全身性炎症和免疫激活状态，从而对AS进展形成抑制。

在“3.2. β-sitosterol ameliorates oxidative stress and inflammation in HAEC”中，论文转向HPRO主要成分β-谷甾醇对内皮细胞的保护作用。在“3.2.1. β-sitosterol ameliorates H₂O₂-induced oxidative damage”中，研究人员在505 μmol/L H₂O₂诱导的HAEC损伤模型中筛选出4 μg/mL为最优保护浓度。通过EdU、Transwell、划痕、β-gal、H&E、Hoechst 33258、Phalloidin、VE-cadherin、MDC/PI及透射电镜（TEM）等证据显示，β-谷甾醇可提高细胞活力，增强增殖、迁移和侵袭能力，减轻细胞衰老和凋亡，维持细胞骨架及黏附连接，促进自噬并缓解超微结构损伤。该部分表明β-谷甾醇能够全面改善氧化损伤条件下的内皮细胞功能障碍。

在“3.2.2. β-sitosterol ameliorates H₂O₂-induced oxidative stress, inflammation, mitochondrial membrane potential, and apoptosis”中，研究人员通过流式细胞术、JC-1和氧化应激指标测定证实，β-谷甾醇降低HAEC凋亡率，改善线粒体膜电位，减少ROS积累，并提升谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）水平，降低丙二醛（MDA）与乳酸脱氢酶（LDH）水平。这说明其抗氧化作用不仅体现在ROS清除，也体现在维持线粒体稳态和增强抗氧化酶系统方面。

在“3.2.3. β-sitosterol ameliorates oxidative damage through the KLF4/Nrf2 pathway”中，研究人员通过mRNA和蛋白水平检测指出，β-谷甾醇在HAEC中上调PPARγ、抑制MAPK，提示其可通过MAPK/PPARγ通路调节炎症反应。同时，KLF4-siRNA干扰实验显示，敲低KLF4后Nrf2和HO-1表达明显下降，且β-谷甾醇诱导的Nrf2升高被削弱，说明KLF4是β-谷甾醇激活Nrf2/HO-1抗氧化轴的重要上游调节因子。由此得出，β-谷甾醇通过KLF4/Nrf2/HO-1和PPARγ/MAPK双通路协同减轻HAEC氧化应激与炎症损伤。

在“3.3. β-sitosterol ameliorates oxidative stress and inflammation in THP-1 cells”中，论文进一步分析β-谷甾醇对单核细胞-巨噬细胞分化的影响。在“3.3.1. β-sitosterol mitigates CD11b/MMP-9/ROS during PMA-induced differentiation and matrix invasion of THP-1 cells”中，研究人员确定10 μg/mL β-谷甾醇为后续干预浓度，并通过Transwell、流式细胞术、RT-qPCR、Western blot和明胶酶谱发现，β-谷甾醇显著抑制PMA诱导的THP-1细胞基质侵袭，降低CD11b和MMP-9的mRNA、蛋白表达及MMP-9酶活，并减少ROS生成。该部分说明β-谷甾醇可抑制单核细胞向黏附型巨噬细胞分化及其对细胞外基质（ECM）的侵袭能力。

在“3.3.2. β-sitosterol modulates the PKC-δ/NADPH oxidase signaling pathway during PMA-induced differentiation of THP-1 cells”中，研究人员发现β-谷甾醇降低NOX2 mRNA表达，抑制p47phox向膜转位，并减少PKC活性及膜结合型p-PKC-δ水平。这表明β-谷甾醇通过抑制PKC-δ/NADPH oxidase信号通路，减少ROS生成，进而抑制CD11b和MMP-9表达以及单核细胞分化相关侵袭行为。

在“3.3.3. The MYD88 inhibitor TJ-M2010-5 and β-sitosterol inhibited the release of TNF-α and the expression of TRAF6 protein”中，研究人员在炎症模型中显示，β-谷甾醇可降低TNF-α释放，并下调TLR4、MyD88、TRAF6和TNF-α的mRNA及蛋白表达。与MyD88抑制剂TJ-M2010-5联用后，这种抑制作用进一步增强。该结果提示β-谷甾醇可通过抑制TLR4/MyD88/TRAF6/TNF-α炎症通路，减轻巨噬细胞炎症反应。

在“3.4. Molecular docking analysis”中，研究人员利用分子对接对β-谷甾醇与PPARγ、MAPK、KLF4、Nrf2、HO-1、CD11b、MMP-9、NOX2、p47phox、PKC-δ、TLR4、MYD88和TRAF6等靶点进行结合分析。结果显示，β-谷甾醇与各靶点结合能均为负值，提示可自发结合，其中与Nrf2和TRAF6结合能较低，提示这两个分子可能是其抗氧化和抗炎效应中的关键作用节点。该部分从结构层面支持了β-谷甾醇多靶点抗AS机制。

在“3.5. Mechanism analysis”中，研究人员综合动物与细胞结果指出，HPRO及β-谷甾醇可通过降低小鼠免疫细胞标志物表达、缓解内皮细胞与巨噬细胞氧化应激和炎症、改善外周血免疫状态而发挥抗AS作用。对于HAEC，核心机制是上调KLF4并激活Nrf2/HO-1信号，同时调控PPARγ/MAPK通路，从而减轻氧化应激、线粒体损伤、衰老和凋亡。对于THP-1细胞，核心机制是抑制PKC-δ介导的NADPH oxidase活化，降低NOX2和p47phox相关ROS生成，进一步减少CD11b和MMP-9表达，并抑制TLR4/MyD88/TRAF6/TNF-α介导的炎症放大。

讨论部分的核心在于，研究将AS的两个关键病理环节——血管内皮氧化损伤和单核细胞-巨噬细胞炎症分化——纳入同一机制框架中，显示β-谷甾醇能够同时作用于氧化应激与炎症网络，从而解释HPRO的综合抗AS效应。论文强调，线粒体ROS失衡与NADPH氧化酶来源ROS共同参与病理进展，而β-谷甾醇通过多通路联动调控，在内皮保护和免疫炎症抑制之间建立了机制关联。这种多靶点、多通路的干预特征，为功能性食用油在慢性心血管疾病预防中的应用提供了理论基础。研究同时指出，现有证据仍主要限于细胞和小鼠水平，提示后续仍需围绕组织功能层面开展进一步研究。

研究结论部分可译为：总之，HPRO能够显著减少AS斑块、改善血脂并降低PWV。主动脉免疫荧光与外周血流式细胞术分析表明，HPRO通过调控主动脉CD68、ET-1、ROS、Ly-6G、Ly-6C和CD11b相关通路减轻AS小鼠症状。此外，β-谷甾醇可能改善HAEC迁移、衰老与凋亡，降低氧化与炎症，改善HAEC功能障碍与损伤，并调节氧化相关KLF4/Nrf2/HO-1通路及脂质生成相关MAPK/PPARγ通路。对PMA诱导THP-1模型的研究显示，β-谷甾醇在单核细胞-巨噬细胞分化过程中的抗AS作用，源于其抑制基质侵袭、减少CD11b和MMP-9合成并调控NADPH oxidase/ROS通路。此外，β-谷甾醇还可能通过TLR4/MyD88/TRAF6/TNF-α通路减轻炎症。总体而言，这些发现提示HPRO在干预AS病变方面具有显著潜力。本研究的局限在于仅在细胞和小鼠层面进行了评价，未来研究应进一步关注HPRO与组织功能之间的关联。本研究为HPRO在AS预防中的应用提供了理论支持。