赤芝(Ganoderma sinense)肽的免疫增强效应：动物实验、分子机制及分子对接研究

《Journal of Functional Foods》：Immunoenhancement effects of Ganoderma sinense peptides: Animal experiments, molecular mechanism and molecular docking

　　

本研究旨在探讨赤芝(Ganoderma sinense)蛋白酶解物中低分子量肽组分（命名为GSP）在体外及体内条件下的免疫调节活性，并从GSP中鉴定候选免疫活性肽，通过分子模拟对接阐明其与T细胞受体（T cell receptor, TCR）的结合模式。研究人员发现GSP通过参与脾淋巴细胞中Ca2+/钙调磷酸酶（calcineurin, CaN）/活化T细胞核因子c1（nuclear factor of activated T cells c1, NFATc1）/干扰素-γ（interferon-γ, IFN-γ）信号通路发挥免疫调节作用。在环磷酰胺（cyclophosphamide, CTX）诱导的免疫抑制小鼠模型中，GSP处理显著升高脾脏和胸腺指数，修复脾脏组织损伤，并使白细胞（white blood cell, WBC）和红细胞（red blood cell, RBC）计数恢复正常。此外，GSP通过促进T/B淋巴细胞增殖活性、巨噬细胞吞噬功能及自然杀伤（natural killer, NK）细胞活性，并升高血清免疫球蛋白M（immunoglobulin M, IgM）/免疫球蛋白G（immunoglobulin G, IgG）水平，显著增强细胞免疫与体液免疫功能。免疫组化分析进一步提示GSP可调节脾脏组织中NFAT及核因子-κB（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-κB）相关蛋白的表达。随后，研究人员从GSP中筛选出15条候选肽并与TCR（PDB ID: 1TCR）采用Autodock Vina进行分子对接，其中YGPAPPPR和FTPNAQIW被预测与TCR具有强结合亲和力，主要通过常规氢键、碳氢键、烷基相互作用、π-烷基相互作用及静电相互作用介导结合。上述肽段可作为后续构效关系研究的候选序列。综上所述，GSP有望成为一种有效的免疫调节剂，在功能性食品及膳食补充剂中具有潜在应用价值。

赤芝低分子量肽(GSP)的免疫增强作用及机制研究解读——《Journal of Functional Foods》论文浓缩总结

免疫系统是由淋巴器官、效应细胞（如T淋巴细胞）及可溶性介质（细胞因子、补体蛋白等）组成的多组分防御网络，可识别清除外来病原体及体内异常细胞，维持机体稳态。免疫稳态失衡可导致感染性疾病、自身免疫病及肿瘤等。环磷酰胺(CTX)诱导的免疫抑制小鼠模型是评价免疫增强物质常用的体内模型。赤芝(Ganoderma sinense，俗称紫灵芝)在中国作为药用及功能性食品已有千年历史，其蛋白酶解物中的低分子量肽段(GSP)在前期研究中被发现可激活RAW264.7巨噬细胞，但其对脾淋巴细胞及整体动物模型的免疫调节作用及分子机制尚不清楚，且其与免疫细胞表面受体的潜在结合模式亦未明确。为此，研究人员开展本研究以明确GSP体外对脾淋巴细胞的作用及信号通路、体内对CTX免疫抑制小鼠的免疫保护效应，并通过分子对接探索候选肽与T细胞受体(TCR)的相互作用，为赤芝深加工及功能性应用提供依据。

主要关键技术方法：

研究人员以永定产区赤芝子实体经碱溶酸沉提取蛋白、胃蛋白酶—胰蛋白酶分步酶解、Sephadex G-25凝胶过滤分离获取低分子量肽组分GSP。体外实验分离ICR小鼠原代脾淋巴细胞，采用MTT法检测增殖，Fluo-3 AM探针流式细胞术测胞内Ca²⁺浓度，试剂盒测CaN活性，q-PCR检测NFATc1 mRNA，ELISA检测细胞因子；并用钙通道阻滞剂维拉帕米(verapamil)和CaN抑制剂环孢素A(CsA)进行通路验证。体内实验建立CTX腹腔注射诱导免疫抑制ICR雄性小鼠模型，设正常对照(NC)、模型对照(MC)、GSP低剂量(25 mg/kg)、GSP高剂量(100 mg/kg)及阳性药香菇多糖(LNT, 80 mg/kg)灌胃干预组，检测体重、脾/胸腺/肝/肾指数、外周血WBC/RBC、脾脏H&E病理、T/B淋巴细胞增殖、NK细胞杀伤、腹腔巨噬细胞吞噬、血清IgG/IgM，并行脾脏组织NFATc1及p65(NF-κB亚基)免疫组化。分子实验部分从GSP中筛选15条候选肽，用PEP-FOLD3.5预测二级结构，AutoDock Vina与TCR(PDB:1TCR)分子对接，GROMACS 2025做100 ns分子动力学(MD)模拟评估复合物稳定性，并用ExPASy PeptideCutter和pepcalc.com预测胃肠消化稳定性及水溶性。

研究结果：

3.1. Characterization of GSP： GSP中87.86%肽分子量<1 kDa，肽含量为593.29 μg/mg，疏水性氨基酸占比15.29%，符合低分子量免疫活性肽特征。

3.2. Effect of GSP on spleen lymphocyte proliferation： 25–100 μg/mL GSP作用48 h显著促进脾淋巴细胞增殖；与ConA或LPS共刺激时也显著增强T、B淋巴细胞增殖反应，呈一定剂量依赖性。

3.3. Cytokines secretion of spleen lymphocytes induced by GSP： GSP显著上调脾淋巴细胞分泌的Th1型细胞因子TNF-α、IFN-γ及IL-6，对Th2型细胞因子IL-4无显著影响，提示GSP偏向促进Th1型免疫应答。

3.4. Ca²⁺concentration in spleen lymphocytes induced by GSP： GSP以剂量依赖方式升高脾淋巴细胞内Ca²⁺浓度，提示其可能启动Ca²⁺依赖性信号级联。

3.5. Effect of GSP on CaN activity, NFATc1 mRNA expression and IFN-γ secretion in spleen lymphocytes： GSP显著提高CaN酶活性及NFATc1 mRNA表达，提示GSP关联CaN/NFATc1轴调控下游IFN-γ基因转录。

3.6. Role confirmation of Ca²⁺in spleen lymphocytes induced by GSP： 钙通道阻滞剂verapamil预处理以浓度依赖方式削弱GSP引起的NFATc1 mRNA上调及IFN-γ分泌增加，证实胞外Ca²⁺内流参与GSP上游信号。

3.7. Role confirmation of CaN in spleen lymphocytes induced by GSP： CaN抑制剂CsA预处理显著抑制GSP诱导的NFATc1 mRNA表达及IFN-γ分泌，证实GSP免疫调节依赖于Ca²⁺/CaN/NFATc1/IFN-γ信号通路。

3.8. Effect of GSP on body weight and organ indices in immunosuppressed mice： CTX致小鼠脾、胸腺指数下降；GSP-H(100 mg/kg)及LNT可显著恢复脾和胸腺指数，对肝、肾指数无影响。

3.9. Effect of GSP on WBC and RBC counts in immunosuppressed mice： CTX致RBC降低、WBC异常变化；GSP和LNT可使RBC及WBC计数恢复至接近正常水平。

3.10. Effect of GSP on spleen morphology in immunosuppressed mice： CTX致脾脏白髓萎缩、出血坏死及红白髓分界消失；GSP或LNT处理后脾细胞排列规整，红白髓边界清晰，细胞数回升，证实GSP减轻CTX所致脾组织损伤。

3.11. Effect of GSP on cellular immunity in immunosuppressed mice： CTX抑制T/B淋巴细胞增殖、NK细胞毒性和巨噬细胞吞噬；GSP-H显著恢复T/B淋巴细胞增殖、提升NK细胞活性及巨噬细胞吞噬功能。

3.12. Effect of GSP on serum IgG and IgM levels in immunosuppressed mice： CTX致血清IgG、IgM下降；GSP-H及LNT可逆转此下降趋势，表明GSP增强体液免疫。

3.13. Effect of GSP on NFATc1 protein expression in spleen tissue of immunosuppressed mice： 免疫组化显示CTX下调脾组织NFATc1蛋白，GSP-H处理使其表达显著回升。

3.14. Effect of GSP on p65 protein expression in spleen tissue of immunosuppressed mice： CTX下调脾组织NF-κB p65蛋白，GSP(低、高剂量)及LNT均可显著提升其表达，提示NF-κB通路也参与GSP体内免疫调节。

3.15. Molecular docking, physicochemical property prediction and MD simulations of candidate peptides from GSP： 自GSP鉴定的15条候选肽与TCR对接结合能均≤?7.7 kcal/mol，其中YGPAPPPR结合最强(?9.5 kcal/mol)，FTPNAQIW等为?8.9 kcal/mol。YGPAPPPR和FTPNAQIW与TCR间形成氢键、碳氢键、烷基、π-烷基及静电/盐桥等多重相互作用。100 ns MD模拟显示两肽—TCR复合物RMSD约10 ns后分别稳定于~0.25 nm和~0.30 nm，Rg值维持在~2.45 nm，表明复合物构象紧凑稳定。部分肽具较好水溶性及模拟胃肠消化稳定性。

讨论与结论翻译总结：

讨论指出GSP可促进脾淋巴细胞增殖并偏向诱导Th1型细胞因子，通过Ca²⁺/CaN/NFATc1/IFN-γ通路活化脾淋巴细胞；在CTX免疫抑制小鼠中GSP恢复免疫器官指数、外周血细胞、脾脏组织学结构，增强T/B淋巴细胞、NK细胞及巨噬细胞功能并提升血清IgG/IgM，体内部分通过上调脾脏NFATc1及p65(NF-κB)蛋白实现；分子对接提示YGPAPPPR等可通过多重相互作用稳定结合TCR，但TCR是否为GSP的功能性识别受体尚需直接生物学验证，且GSP为混合肽，活性可能为多肽协同效应。

结论：研究人员自赤芝蛋白酶解物中分离得到低分子量肽GSP。GSP在体外促进脾淋巴细胞中Th1及B细胞增殖，并在CTX免疫抑制小鼠中提高免疫器官指数、恢复外周血WBC/RBC、修复脾脏结构、增强细胞(T/B/NK/巨噬细胞)及体液(IgG/IgM)免疫功能，体内涉及NF-κB及NFATc1相关信号通路调控；分子对接显示YGPAPPPR可与TCR发生多价协同结合，可能进而影响下游Ca²⁺/CaN/NFATc1信号。赤芝来源肽有望作为增强免疫系统的功能性食品或膳食补充剂活性成分。