体内碱基编辑（In vivo base editing）缓解HFE相关性遗传性血色素沉着症（Hereditary Hemochromatosis, HC）模型小鼠的肝铁蓄积与纤维化

《Journal of Hepatology》：In vivo base editing alleviates hepatic iron accumulation and fibrosis in models of HFE-related hereditary hemochromatosis

　　

背景与目的：HFE相关性遗传性血色素沉着症由HFE基因功能缺失突变引起，其中C282Y纯合变异占确诊患者的80%–90%，可导致肠道铁吸收过度及肝铁沉积，未治疗可进展为肝纤维化、肝硬化及肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）。本研究旨在评估脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticle, LNP）递送腺嘌呤碱基编辑器（Adenine Base Editor, ABE）mRNA及sgRNA，在体内外纠正HFE C282Y突变的安全性及有效性。方法：研究人员采用LNP包裹ABEmax mRNA与靶向小鼠Hfe C282Y位点的sgRNA（mG17），经尾静脉单次注射至携带人HFE C282Y同源突变（129-Hfetm1.1Nca/J）的小鼠体内；同时以HFE C282Y纯合患者来源的诱导多能干细胞（induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs）分化为肝细胞样细胞（Hepatocyte-Like Cells, HLCs），以LNP包裹人适配sgRNA（hG17）进行体外编辑。结果：原代小鼠肝细胞体外编辑效率达73.6 ± 4.9%，小鼠体内肝组织编辑率达约67%（短期）及长期稳定约47%–49.5%；下一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）未在含1–2个错配的潜在脱靶位点检出脱靶编辑。经治小鼠在高铁饮食下肝非血红素铁显著降低（约-41.3%），血清铁调素（Hepcidin, HAMP）升高，转铁蛋白不饱和铁结合力（Unsaturated Iron-Binding Capacity, UIBC）增加，血清铁及转铁蛋白饱和度（Transferrin Saturation, TSAT）下降；转录组分析显示纤维化及肝癌相关基因特征下调。患者iPSC-HLCs中C282Y校正率可达63.8 ± 0.8%，无检出脱靶活性。结论：LNP介导的ABE递送可在体内及人源细胞中安全、高效地纠正HFE C282Y突变，有效减轻肝铁蓄积并抑制纤维化相关转录特征，为非病毒体内基因矫正治疗HFE相关性HC提供了概念验证。意义与影响：目前HFE C282Y相关性血色素沉着症缺乏病因治疗，存在铁负荷驱动肝病风险，本研究表明LNP介导ABE可实现高效肝细胞编辑并改善生物标志物，具转化潜力，但仍需在大型动物及长期研究中进一步验证。

本文对发表于《Journal of Hepatology》的研究"In vivo base editing alleviates hepatic iron accumulation and fibrosis in models of HFE-related hereditary hemochromatosis"进行解读总结。

研究背景

遗传性血色素沉着症（Hereditary Hemochromatosis, HC）是北欧人群常见的代谢性肝病，患病率约1:300–1:500，80%–90%病例由HFE基因C282Y纯合突变（c.845G>A，p.Cys282Tyr）导致。HFE蛋白功能障碍使肝细胞无法感知循环铁负荷，致使肝铁调素（Hepcidin, HAMP）表达下调，肠道铁吸收失控，引发肝铁沉积、氧化应激、炎症，最终可致肝纤维化、肝硬化及肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）。现行标准疗法为终身放血（Phlebotomy）或口服铁螯合剂（如Deferasirox），但分别为侵入性操作和具肾毒性及胃肠副作用，且不能纠正根本遗传缺陷。既往研究用腺相关病毒（Adeno-Associated Virus, AAV）载体递送碱基编辑器效率低（6%–10%）且持续表达存安全隐患。因此，研究人员拟采用肝脏靶向脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticle, LNP）瞬时递送腺嘌呤碱基编辑器（Adenine Base Editor, ABE；ABEmax）mRNA及sgRNA，以"打跑（hit-and-run）"策略在体内纠正HFE C282Y突变，评估其疗效与安全性。

主要关键技术方法

研究人员使用129-Hfe^tm1.1Nca/J（HFE C282Y Knock-in）小鼠及同窝野生型对照，部分实验用BALB/c及129S2/SvPasOrlRj小鼠；患者样本来自HFE C282Y纯合HC患者外周血重编程获得诱导多能干细胞（induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs）并分化为肝细胞样细胞（Hepatocyte-Like Cells, HLCs）。关键技术包括：微流控或T混合法制备负载ABEmax mRNA与sgRNA（小鼠mG17／人hG17）的肝靶向LNP；小鼠尾静脉单次注射LNP-ABE；原代小鼠肝细胞（Primary Murine Hepatocytes, PMHs）及HLCs体外LNP转染；Sanger测序结合BEAT算法、深度下一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）定量靶点击中率及脱靶分析（Cas-OFF-Finder预测位点）；肝非血红素铁Ferrozine法检测、普鲁士蓝（Prussian Blue）染色、羟脯氨酸（Hydroxyproline）定量、天狼星红（Sirius Red）染色；血清铁代谢指标（铁、UIBC、TSAT、HAMP ELISA）；肝原代肝细胞RNA测序（RNA-seq）及差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）、KEGG/GO富集分析；光学基因组图谱（Optical Genome Mapping, OGM）检测结构变异（Structural Variants, SVs）。

研究结果

Liver-specific and safe delivery of RNA using LNP（LNP实现肝脏特异性及安全的RNA递送）

研究人员将包载萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase, FLuc）mRNA的LNP经尾静脉注入BALB/c小鼠，IVIS成像证实荧光信号呈剂量依赖性富集于肝脏。给予129-Hfe^tm1.1Nca/J小鼠2 mg/kg LNP-ABE-mG17后，雄性小鼠血清谷丙转氨酶（Alanine Aminotransferase, ALT）与谷草转氨酶（Aspartate Aminotransferase, AST）较PBS对照组无显著升高，雌性小鼠出现>10倍短暂升高但7日内恢复正常，整体健康状况及体重无影响；24 h血清IFN-γ、KC、MCP-1、IL-1β、IP-10、IFN-α轻度上调，呈性别差异。肝及脾24 h RNA-seq示少量差异表达基因（DEGs），多为性别特异性。结论：LNP可特异且较安全地靶向肝脏递送ABE mRNA，仅雌性出现可逆性短暂转氨酶升高。

LNP-ABE-mG17 corrects the C282Y variant in murine hepatocytes ex vivo and in the liver of 129-Hfe^tm1.1Nca/J mice（LNP-ABE-mG17在体外及129-Hfe^tm1.1Nca/J小鼠肝内纠正C282Y变异）

PMHs经LNP-ABE-mG17处理5 d，Sanger/BEAT分析示500 ng/孔组碱基编辑效率73.6 ± 4.9%。小鼠体内单次注射2 mg/kg，4周时肝组织编辑率24.0 ± 6.4%；高铁饮食长期实验（4、8个月）维持约47.9%–49.5%，旁观者编辑（Bystander editing）A₈、A₉位极低（≤1.7%）。纠正后HFE正确mRNA占比分别达64.9%（4月）与54.9%（8月）。短期实验中治疗组肝非血红素铁较PBS组降低约41.3%，血清HAMP上调（1.4 ± 0.35倍），UIBC升高2.7倍，血清铁降28.6%、TSAT降17.4%；长期实验普鲁士蓝染色及铁定量证实治疗组肝铁蓄积受抑且无随时间加重趋势，羟脯氨酸含量及天狼星红染色未见明显纤维化。结论：LNP介导C282Y体内校正可有效改善铁稳态指标并减轻肝铁负荷。

Analysis of organ genotoxicity reveals a high safety profile in ABE treated mice（器官基因毒性分析显示ABE治疗小鼠具高安全性）

深NGS检测4个月时点多器官，脑、心、肺、肾、性腺无靶点击中，脾与胰腺仅≈1%（可能为技术背景）；9个预测脱靶位点（≥2错配或1 bulge）均无显著脱靶突变。肝细胞RNA-seq显示LNP组与外对照PBS组在外显子SNP及Indel数量上无增加，部分时点LNP组甚至少于对照，差异属小鼠品系背景多态性。结论：LNP-ABE在DNA及RNA水平均未检测到有意义脱靶编辑或突变负荷升高。

In vivo correction of the C282Y variant counteracts transcriptional changes induced by high iron diet（体内C282Y纠正拮抗高铁饮食诱导的转录改变）

对4月及8月肝细胞RNA-seq进行DESeq2分析，PBS组随高铁喂养时间延长（8月 vs 4月）显著富集KEGG肝癌（mmu05225）、NAFLD/MASLD（mmu04932）、泛癌通路（mmu05200）及TGF-β/MAPK/JAK-STAT/PI3K-Akt信号，GO示细胞外基质重塑、白细胞趋化、血管生成上调；而LNP治疗组8月与4月间无此病理转录漂移，且PBS_8m vs LNP_8m差异同PBS_8m vs PBS_4m模式—即LNP处理阻断了铁过载驱动的纤维化/癌前转录特征上调。结论：体内碱基编辑可预防高铁负荷引发的致病性肝转录重编程。

Patient specific iPSC-derived hepatocytes serve as a preclinical model for therapeutic C282Y correction（患者特异性iPSC源性肝细胞作为治疗性C282Y纠正的临床前模型）

研究人员从HFE C282Y纯合患者外周血建系iPSC（HH01），核型正常（46,XY），多能性标记（NANOG、OCT4、SOX2、SSEA-1、TRA-1-60）阳性，光学基因组图谱（OGM）确认无致病性结构变异（仅2个<5 kb非编码区SVs为重编程特有）。经STEMdiff?方案分化为HLCs，形态及Albumin、CYP3A4表达符合肝细胞特征，OCT4低表达。结论：患者iPSC-HLCs可作为人源临床前评价模型。

Investigation of genotoxicity in patient-derived hepatocyte like cells（患者源性肝细胞样细胞中的基因毒性考察）

HLCs在分化第20天接受LNP-ABE-hG17，4 d后NGS示靶位A₅A>G校正率63.8 ± 0.8%；旁观者A₈（T281A）9.9 ± 0.7%、A₁（Q283R）0.5 ± 0%，AlphaMissense预测均为可能良性（得分0.079、0.086），ClinVar无致病记录。5个人预测脱靶位点（含PTGDR2编码区）深NGS未检出＞0.1%频率变异（个别0.1%同PBS对照属背景噪音）。OGM比较处理/未处理iPSCs未发现治疗相关结构变异。结论：人源HLCs中LNP-ABE高效纠正C282Y且无显著脱靶及大片段重排。

讨论与结论总结（翻译浓缩讨论中结论部分）

本研究证明LNP递送ABEmax mRNA与sgRNA可在HFE C282Y模拟小鼠中实现肝细胞高达约49.5%的A>G碱基纠正（较既往AAV-split系统提高5–10倍），单次注射即显著减轻高铁饮食下的肝铁蓄积并抑制纤维化/癌变相关转录特征上调。LNP具肝脏趋向性，全身其他器官尤其性腺无编辑，深度测序未见脱靶，RNA水平SNP/Indel谱与对照无异，人iPSC-HLCs达相似校正效率且无检出的脱靶或结构变异（旁观者编辑产物预测良性）。雌性小鼠出现短暂ALT/AST升高并于一周内恢复，提示临床转化中或可考虑短程免疫抑制预防。局限性含小鼠模型表型偏轻、超生理铁负荷及长期血清参数受HFE非依赖铁调节影响。综上，LNP介导体内HFE C282Y碱基编辑在小鼠及人源细胞中安全有效，可缓解肝铁过载及病理转录改变，为HFE相关性遗传性血色素沉着症的非病毒因果治疗提供了有力临床前依据，后续需在大型动物及更长时程研究中验证。