从花卉到传粉者：欧洲农田中 honey bees、bumble bees 与 solitary bees 对微量元素的膳食暴露

《Journal of Hazardous Materials》：From flowers to pollinators: dietary exposure of honey bees, bumble bees and solitary bees to trace elements across European fields

　　

微量元素（Trace Elements）属于持久性污染物，可通过花粉（pollen）、花蜜（nectar）、土壤衍生颗粒及大气沉降进入蜜蜂膳食，然而针对传粉者类群的野外暴露数据仍十分有限。本研究检测了128个位于欧洲八国（Estonia、Sweden、Ireland、United Kingdom、Germany、Switzerland、Italy、Spain）苹果园与油菜田中的西方蜜蜂（western honey bee, *Apis mellifera*）、熊蜂（buff-tailed bumble bee, *Bombus terrestris*）及红壁蜂（red mason bee, *Osmia bicornis*）储粮花粉中18种微量元素（Al、As、Ba、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Hg、Mg、Mn、Mo、Ni、Pb、Se、U、V、Zn）的含量。研究人员评估了物种、作物及景观相关驱动因素对储粮花粉及蜜蜂工蜂体内元素富集的影响，并利用这些数据估算了膳食暴露量及风险。

储粮花粉中的微量元素水平存在作物与物种特异性差异。红壁蜂花粉中的多种元素浓度较蜜蜂与熊蜂花粉高数倍，提示蜜蜂可能不适用于花粉暴露研究的模式生物。苹果园储粮花粉中的Cu含量高于油菜田，推测与铜基杀菌剂（Cu-based fungicide）使用有关。景观特征包括作物覆盖度与城镇覆盖度均对储粮花粉及蜜蜂工蜂体内元素浓度产生影响。

研究人员针对As、Cd、Cu、Hg进行了急性风险评价（Acute Risk Assessment），并对As与Cd进行了慢性风险评价（Chronic Risk Assessment）。对于具有可用毒性终点的元素，估算膳食风险为可忽略或较低；对于缺乏此类终点的元素，尽管存在暴露估算，仍无法量化风险。独居蜂的较高暴露水平以及毒性数据的匮乏表明，未来研究应聚焦于建立物种特异性毒性终点（Species-specific Toxicity Endpoints）。

传粉者在开花植物繁殖过程中发挥关键作用，进而维系生态系统平衡与全球粮食生产。蜜蜂作为最为有效且分布广泛的传粉者，对多种野生与栽培植物的传粉具有不可替代的价值。然而，全球蜜蜂种群正面临由多种胁迫因子驱动的严峻下降态势，包括栖息地丧失、病原体出现、开花植物多样性降低导致的营养缺乏、气候变化、农用化学品暴露以及其他环境污染物。尽管关于合成农用化学品对蜜蜂膳食影响的研究已较为丰富，但环境暴露于高浓度微量元素的程度与效应仍研究不足。

蜜蜂通过多种途径暴露于微量元素：包括 floral resources 与水源的膳食暴露、空气颗粒物以及土壤直接接触。微量元素的生物可利用性及其稳态（homeostasis）对蜜蜂维持正常生理功能至关重要。Cu、Fe、Mg、Mn、Zn等必需微量元素参与多种酶促反应，但过量则会对昆虫关键生理过程产生不利影响。As、Cd、Hg、Pb等有毒微量元素可在昆虫组织中累积，干扰多种生化过程，导致免疫功能受损、病原体易感性增加、繁殖障碍、行为改变，最终威胁蜂群适合度（fitness）与存活。不同传粉者类群因管理状态差异其暴露途径与生态互作亦不相同：西方蜜蜂为完全管理型传粉者，而熊蜂与红壁蜂等独居蜂虽存在野生种群，目前也在农业系统中被广泛用作管理型传粉者，这些生态与管理差异凸显了多类群研究的必要性。

人类活动如工业、道路交通与集约化农业是微量元素排放的主要来源。高比例城镇或集约农耕区域可能显示更高的土壤与生物体中特定元素水平。人为排放至土壤的元素可被植物吸收、在器官中累积，并向花蜜与花粉等 floral resources 转移，从而为传粉者所获取。花粉受空气颗粒物污染则是另一暴露途径。蜜蜂采集的花粉作为幼虫与成蜂的食物资源，一生均可作为多种金属与类金属的膳食来源。蜜蜂及蜂相关基质从不同环境区间累积元素的能力使其成为环境微量元素污染的有效生物指示剂（biomonitors），但不同基质的适用性差异显著。

油菜（*Brassica napus*）与苹果（*Malus domestica*）为全球广泛栽培、经济价值显著的集约化作物。油菜是全球种植面积最广的作物之一，而苹果种植覆盖90余个国家。两种作物均提供丰富 floral resources 且在不同程度上依赖昆虫传粉，但其集约化栽培可能对当地生态系统产生负面影响。值得注意的是，油菜属于十字花科，该科包含已知的金属累积植物（metallophytes），许多油菜品种对金属胁迫具有抗性，能够从土壤中累积特定金属，因而可用于重金属污染场地的植物修复（phytoremediation）。

本研究旨在评估欧洲八国苹果园及油菜田中国家西方蜜蜂、熊蜂及红壁蜂采集的储粮花粉中18种微量元素的水平，并测定同址蜜蜂工蜂体内相应元素含量，以识别影响元素含量变异的主要因素，包括蜂种、作物类型及研究区域内耕地与城镇的相对比例。此外，研究人员估算了成年蜜蜂、熊蜂及红壁蜂对这些微量元素的经口暴露量，并评估了对这些传粉者的潜在急慢性风险。

该研究于PoshBee项目框架下开展，从欧洲八国128个采样点采集样本，覆盖四个生物地理区。每国选取16个样点，均分为苹果与油菜两种种植系统，8个样点沿土地利用强度梯度分布并包含1个有机栽培样点。每样点放置3群蜜蜂、3群熊蜂及3个红壁蜂巢，遵循统一规程。红壁蜂未在英国与爱尔兰使用。研究人员从每个样点的3群/巢中按比例等量采集储粮花粉，每个物种每样点仅采样一次。蜜蜂与熊蜂采样于焦点作物花期末期，红壁蜂则于花期盛期采样。蜂蜜蜂储粮花粉从至少5张巢脾中切取封盖花粉脾，每群不少于5 g，等量混合后每样点约15 g。熊蜂储粮花粉于花期结束后冷冻终结蜂群，从巢室中提取花粉并等量混合至约15 g。红壁蜂于花期盛期采集约10根巢管，移除卵与幼虫后收集花粉并等量混合至约15 g。样品均冷冻运输至波兰国家兽医研究所食品与饲料化学研究部进行均质化处理，最终306份储粮花粉样品中，蜜蜂储粮花粉123份、熊蜂96份、壁蜂87份用于微量元素测定。

136份蜜蜂工蜂样本采集后送至法国食品、环境及劳动卫生安全署（ANSES）进行元素分析，每样点从3群蜂的巢脾边框采集20只内勤蜂共60只，等量混合后冷冻运输。景观特征采用EUNIS生境分类系统，在1:2500比例尺下通过ArcGIS Pro对采样点1 km半径范围内的景观要素进行数字化，本研究关注耕地与果园（统称"crops"）及城镇用地的百分比。

储粮花粉微量元素分析采用微波消解法：约200 mg样品加入3 mL 67% HNO₃及0.5 mL 30% H₂O₂，经Speedwave Four微波消解系统处理后，用7700x型电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）测定Al、As、Ba、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Mg、Mn、Mo、Ni、Pb、Se、U、V、Zn含量，外标法定量，内标校正仪器漂移与基质效应。Hg采用Tri-cell DMA-80^?直接测汞仪以原子吸收光谱法测定，样品直接燃烧后经金汞齐富集检测。所有方法均经PN-EN ISO/IEC 17025:2018标准认可，并通过欧盟参考实验室能力验证。

蜜蜂工蜂多元素分析在ANSES微量元素与纳米材料实验室进行。样品经冷冻干燥后用BM500台式实验室球磨机均质，约0.5 g样品以3 mL 65% HNO₃预消化2小时后，用Multiwave Pro消解系统处理，稀释至50 mL后以ICP-MS分析。同样采用外标法与多元素内标（Sc、In、Bi、Ru、Y），6% HNO₃含金(Au) 10 mg·L^-1的洗涤液用于减少Hg记忆效应。方法验证参数包括真实性、准确度、精密度、检出限（LODs）与定量限（LOQs）。

为表征地球化学背景，研究人员从GEMAS数据集提取各研究点位农业表层土（0–20 cm）的微量元素浓度数据，取最近格网点值用于比较可视化（热图），但未纳入统计模型以避免50×50 km网格分辨率导致的空间不匹配偏差。

统计分析采用R 4.3.2版本，left-censored数据（低于LOQ）以Kaplan–Meier非参数技术插补。因数据呈非正态分布且对数转换未能改善，采用非参数稳健方法。以稳健线性混合效应模型（rlmer函数）分析作物类型（苹果vs油菜）、蜂种（蜜蜂、熊蜂、壁蜂）及景观比例（作物%、城镇%）对储粮花粉及蜜蜂工蜂元素浓度的影响，国家因子作为随机效应纳入模型。热图基于中位值经z-score标准化处理以增强国家间差异的视觉比较。

暴露与风险评价方面，膳食暴露定义为经口摄入受污染储粮花粉导致的急慢性微量元素暴露。采用中位浓度估算慢性暴露，90th百分位浓度估算急性暴露。花粉消费量依据EFSA指南：成年蜜蜂11.6 mg·bee^-1·day^-1，熊蜂11.7 mg·bee^-1·day^-1，独居蜂0.6 mg·bee^-1·day^-1。急性口服半数致死量（LD₅₀）数据来源于公开数据库，熊蜂与独居蜂的毒性数据依据EFSA建议用毒性外推系数（TEF）从蜜蜂数据外推：熊蜂TEF=2.4，独居蜂TEF=171。慢性毒性以10天半数致死膳食剂量（LDD₅₀）表示，急性风险以%LD₅₀表示，慢性风险以%LDD₅₀表示。

研究结果部分，储粮花粉中18种微量元素大多可定量，仅As、Hg、U在蜜蜂与熊蜂储粮花粉中存在较多left-censored数据。元素组成呈现明显的蜂种与国家间差异模式。蜜蜂与熊蜂储粮花粉及蜜蜂工蜂中的元素浓度模式相似，而红壁蜂储粮花粉显著不同。

红壁蜂储粮花粉中绝大多数元素浓度较蜜蜂与熊蜂高数倍。Al、As、Pb、V的中位浓度在壁蜂中分别为887、0.398、0.656、2.641 μg·g^-1 ww，而蜜蜂中分别为14.6、0.009、0.047、0.034 μg·g^-1 ww，熊蜂中分别为20.6、0.013、0.062、0.049 μg·g^-1 ww。Al在壁蜂中较其他两种蜂高40倍以上，As高29倍，Cr高19倍，Fe高12倍，Pb高10倍，V高53倍。熊蜂与蜜蜂浓度 broadly similar，仅Mn、Mo、Ni略高，Mg略低。这些差异反映筑巢生态学与觅食行为的差异而非仅 floral exposure：红壁蜂作为洞穴营巢蜂种，以泥土分隔育虫室，可直接引入土壤源性微量元素。尽管热图未显示壁蜂储粮花粉与表层土浓度间的一致对应关系（可能由于数据时空不匹配），土壤接触应视为壁蜂的合理附加暴露途径。

物种特异性觅食偏好亦有助于解释红壁蜂的暴露特征。基于同套样品的花粉分析显示，蜜蜂与熊蜂主要采集焦点作物花粉但替代非作物植物偏好差异显著，而壁蜂主要偏好田边、树篱及木本植物的非作物花粉。非作物植被可能具有不同的暴露历史与生物累积特性，加之壁蜂较短的觅食范围与有限的花粉混合，可能放大局部污染效应。

苹果园储粮花粉Cu含量显著高于油菜田，归因于苹果黑星病等病害防治中铜基杀菌剂的广泛应用，有机栽培条件下亦被授权使用。欧洲12国调查显示苹果栽培中铜基杀菌剂使用量为油菜病害防治的16倍。大多数其他元素在苹果园中倾向于较高但差异不显著。Mo呈现相反模式，油菜田高于苹果园，推测与油菜对Mo缺乏敏感而施用Mo肥有关。

景观特征方面，Mo与Se在储粮花粉中的含量与作物及城镇覆盖度呈显著正相关，可能与肥料使用及大气沉降或自然土壤富集有关。Cd、Ba、Mn浓度与作物覆盖度呈负相关，Ba亦与城镇覆盖度负相关，这与农业石灰提高土壤pH从而降低Mn、Ba溶解度与植物可利用性有关，Ba还可因硫酸盐肥料施用形成硫酸钡沉淀而降低可利用性。Pb与Zn虽通常与交通及工业污染相关，其与城市覆盖度的正相关关系在本研究中未达显著，显示微量元素在农业与城镇景观中迁移途径的复杂性。

蜜蜂工蜂中多数元素可定量，仅Hg在98%样品中低于LOQ。元素水平通常低于文献报道。苹果园工蜂中As、Ba、Cd、Cu、Fe、Mn、Mo、Pb、Se、V、Zn浓度高于油菜田，与蜜蜂储粮花粉中的累积模式一致，提示相同暴露来源。但Mn、Mo呈现相反模式，指示不同来源。景观效应上，Mn、Zn与作物覆盖度负相关，V、Pb与作物覆盖度正相关，Pb在工蜂与储粮花粉中呈现相反的作物覆盖度关联，可能源于多重独立暴露途径：空气颗粒物可附着于蜂体表面与花粉粒，元素特定的毒物动力学与稳态调节可造成膳食暴露与体内残留的非线性关系。需注意的是，分析的工蜂为巢脾边框的约三周龄内勤蜂，已完成哺育期，未必摄食了花期采集的储粮花粉，因此储粮花粉与工蜂体元素浓度缺乏直接相关性在生物学上具有合理性。

风险评价结果显示，急性暴露对所有分析元素均进行了计算，但急性风险仅对Cr、Cu、Mn、Zn（所有蜂种）及Cd（熊蜂）进行了估算。蜜蜂与熊蜂的急性风险可忽略，独居蜂风险较高。直接使用蜂种特异性LD₅₀时，蜜蜂暴露于Cu的风险最高为1% LD₅₀。使用外推数据时，熊蜂与独居蜂暴露于Mn的急性风险分别达1.9%和22.8%外推LD₅₀，独居蜂的高TEF值（171）是重要不确定性来源。慢性风险仅对As和Cd进行了评价，结果均为可忽略。虽As、Cd、Hg、Pb被认为是对生物体最具毒性的元素，本研究未发现蜜蜂、熊蜂及独居蜂暴露于花粉中As、Cd的慢性风险。U.S. EPA BeeRex模型中急性风险关注水平为RQ=0.4（即40% LD₅₀），本研究未达此水平。

讨论部分，研究人员指出储粮花粉中微量元素含量的蜂种差异可能反映物种特异性觅食行为、floral preferences、 distinct nesting ecologies 及潜在暴露途径。苹果园较高Cu含量与铜基杀菌剂使用相关，油菜田较高Mo与Mo肥施用有关。尽管所有蜂种暴露于相同景观，其花粉储粮的元素组成显著不同，尤其红壁蜂。蜜蜂与熊蜂储粮花粉无显著差异，但独居蜂哺育室中的花粉由泥土或土壤分隔，可能代表额外的暴露途径。物种特异性元素特征提示蜜蜂作为评估其他传粉昆虫微量元素暴露的模式生物存在局限性，尤其对具有 distinct nesting ecologies 与觅食范围的独居蜂种。

研究结论指出，本研究提供了欧洲多样景观中储粮花粉与蜜蜂工蜂微量元素富集的大规模评估。储粮花粉中微量元素含量可因巢址周围主导作物而变化，Cu与Mo的例子表明植物保护与作物施肥措施可影响储粮花粉中金属浓度。鉴于目前对蜜蜂毒性阈值的了解，对于具有可用毒性终点的元素，摄食储粮花粉相关的膳食风险被认为低或可忽略。但对传粉昆虫金属毒性的理解仍存在显著空白，限制了综合风险评价能力。未来研究应聚焦于建立物种特异性毒性终点，尤其针对独居蜂，并评价环境现实暴露情境下的亚致死效应与元素间相互作用。