综述：中性粒细胞及中性粒细胞胞外诱捕网在健康与炎症性皮肤中金黄色葡萄球菌定植中的作用

《Journal of Investigative Dermatology》：The role of neutrophils and neutrophil extracellular traps in Staphylococcus aureus colonization in healthy and inflamed skin

　　

金黄色葡萄球菌（S aureus）是皮肤感染的常见致病菌，并在特应性皮炎（atopic dermatitis, AD）患者皮肤上高度富集，其可加重炎症并驱动皮肤屏障缺陷。中性粒细胞通过其抗微生物活性以及招募其他免疫细胞而有助于控制S aureus感染；然而，其也可能促进S aureus皮肤定植。中性粒细胞过度活化及中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps, NETs）的释放可损害皮肤屏障，并由此促进定植。此外，S aureus已进化出逃逸中性粒细胞防御的多种策略。本文综述了健康及炎症性皮肤中中性粒细胞-皮肤相互作用，以及靶向这些相互作用以减少诸如AD等疾病中S aureus定植的潜在治疗策略。

Introduction

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S aureus）是人类多数皮肤及软组织感染的主要病原体之一。稳态条件下，皮肤依赖物理屏障、微生物屏障及免疫屏障共同抵御S aureus。表皮以角质形成细胞（keratinocytes）为主，通过角质层、紧密连接、脂质、脂肪酸及酸性pH构成不利于病原体入侵的环境。共生菌群则通过产生抗微生物物质、维持屏障完整性及调节免疫反应增强防御能力。免疫学层面上，角质形成细胞及驻留或募集的免疫细胞可识别S aureus，诱导细胞因子和抗菌肽（antimicrobial peptides, AMPs）产生，从而直接限制病原体并募集效应细胞。上述机制共同维持皮肤稳态并限制S aureus定植。然而在特应性皮炎（AD）等炎症性皮肤病中，这种平衡被打破，S aureus过度生长反过来进一步加重炎症并推动皮肤屏障功能障碍。

中性粒细胞是在S aureus感染时最早浸润皮肤的免疫细胞，可通过多种抗菌机制杀灭细菌并阻止其向深部组织扩散。除直接抗菌外，中性粒细胞还与皮肤中的其他免疫细胞及角质形成细胞相互作用，或进一步招募、激活更多免疫细胞，从而增强针对S aureus的保护性免疫反应。然而，中性粒细胞对S aureus定植的抑制作用具有情境依赖性；在若干炎症性和感染性皮肤病中，中性粒细胞增多反而与S aureus皮肤定植增强相关。尤其是NETs的释放及其与角质形成细胞的相互作用，可能导致皮肤屏障缺陷，并在AD等疾病中促进S aureus定植。与此同时，S aureus还具备逃逸中性粒细胞及NETs杀伤的能力，使其定植和感染管理更加复杂。基于此，文章聚焦健康与炎症状态下中性粒细胞、NETs与角质形成细胞之间的相互作用，并讨论其在S aureus定植中的双重意义。

S aureus as Driver of Inflammatory Skin Diseases

S aureus是全球范围内导致皮肤炎症和感染的重要病原体，并可引发严重、危及生命的系统性疾病。其可无症状定植于约30%的人群，主要位于鼻腔，并在皮肤屏障破损后成为后续感染的重要危险因素。与此同时，S aureus快速获得抗生素耐药性的能力，凸显了开发新型定植控制与感染管理策略的临床迫切性。

在健康皮肤中，角质形成细胞、皮肤微生物群与免疫细胞之间的精细调控相互作用维持屏障完整并阻止S aureus定植。而在AD中，这一平衡失调，表现为皮肤屏障功能障碍和微生态失衡，约90%的患者皮肤可检出S aureus。该菌通过多种毒力因子直接参与AD发病，包括酚溶性调节蛋白（phenol-soluble modulins, PSMs）、成孔毒素、超抗原及病原体相关分子模式，进而驱动炎症、免疫逃逸及进一步的屏障损伤。

除AD外，S aureus还与其他炎症性皮肤病相关，如系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）。既往研究显示，S aureus与SLE存在显著关联，且皮肤型狼疮病灶常伴有S aureus定植。机制上，SLE中升高的I型干扰素（type I interferon, IFN）信号可破坏表皮屏障，从而增强患者角质形成细胞对S aureus的黏附。局部抗生素治疗在降低S aureus定植的同时可伴随IFN水平下降，提示微生物负荷与炎症信号之间存在功能联系。

此外，S aureus在慢性创面中亦高度常见，并与创面愈合不良密切相关。例如，表皮松解性大疱病、化脓性汗腺炎及静脉性溃疡等慢性病变中均可见其广泛定植。持续性炎症可造成组织损伤和修复延迟，而S aureus则利用受损屏障及其毒力因子黏附并侵袭组织，同时通过生物被膜形成增强抗生素耐受和免疫逃逸。由此，S aureus定植与皮肤屏障功能障碍之间构成双向促进关系，使其成为炎症性皮肤病治疗中的关键靶点。

Neutrophil-Mediated Defense in S aureus Skin infections

角质形成细胞可通过模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs），如Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs），感知表皮表面的S aureus，并启动包括中性粒细胞趋化因子分泌在内的炎症级联反应，进而募集作为先天免疫关键效应细胞的中性粒细胞进入皮肤。动物模型表明，中性粒细胞对控制S aureus定植、阻止真皮侵袭及预防系统性感染至关重要；而中性粒细胞功能受损则与复发性、重症S aureus皮肤感染密切相关。

Antimicrobial mechanisms of neutrophils

中性粒细胞通过多种机制直接对抗S aureus。首先是吞噬作用，即通过PRRs识别并内化S aureus，该过程可被抗体及补体调理作用显著增强。吞噬后，中性粒细胞在吞噬体内释放活性氧（reactive oxygen species, ROS）和颗粒来源蛋白等效应分子。髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH oxidase）介导的ROS生成是这一通路的关键组成，其重要性可由NADPH oxidase缺陷患者易发生复发性重症感染这一现象得到印证。

除ROS外，中性粒细胞还通过脱颗粒发挥抗菌作用。其颗粒内预先储存大量效应蛋白，分布于不同颗粒亚群中，可根据刺激动态释放，从而在增强杀菌效能的同时尽量减少附带组织损伤。另一重要机制是NETosis，即中性粒细胞释放NETs。NETs为含有染色质骨架的网状结构，其中富含组蛋白、丝氨酸蛋白酶、MPO、钙卫蛋白（calprotectin）、猫elicidin及防御素等抗菌成分。细菌诱导的NETosis中，微生物大小和聚集状态会影响中性粒细胞选择吞噬还是形成NETs。NETs可限制病原体扩散并使其暴露于局部高浓度抗菌效应物。S aureus主要诱导非裂解性（non-lytic）NETosis，该过程不依赖ROS，也不导致质膜破裂，最终形成仍保有吞噬能力的无核细胞质体（cytoplast），有助于局限感染并阻止细菌系统播散。

此外，多种细胞因子和损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns, DAMPs）也可诱导NETosis，如晚期糖基化终产物受体（receptor for advanced glycation end products, RAGE）配体S100A蛋白、高迁移率族蛋白B1（high-mobility group box 1, HMGB1）、白细胞介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等。由于NETs含有大量细胞毒性和促炎成分，其及时清除对防止组织损伤至关重要；巨噬细胞可在内源性脱氧核糖核酸酶I（DNase I）预先裂解NETs后，经内吞及溶酶体降解实现清除。

The immunomodulatory role of neutrophils and NETs during S aureus skin infection

除直接抗菌外，中性粒细胞还具有重要免疫调节功能。在炎症部位，其寿命延长以保证有效防御，而皮肤中的角质形成细胞或成纤维细胞可进一步增强中性粒细胞生存和活化。最新研究甚至提示，驻留于皮肤的中性粒细胞还可产生细胞外基质蛋白，从而增强皮肤屏障功能并帮助抵御病原体入侵。

中性粒细胞与多类皮肤细胞相互作用。例如，其表达G蛋白偶联受体Mrgpra2，可结合角质形成细胞来源的β-防御素；在小鼠中删除Mrgpra2基因会导致皮肤微生物群多样性下降及葡萄球菌属丰度上升，提示中性粒细胞参与维持皮肤微生态平衡。此外，在创伤修复过程中，中性粒细胞可产生趋化因子CXCL10，并与微生物群来源DNA形成复合物，从而激活浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells, pDCs）分泌I型IFN，继而刺激巨噬细胞和成纤维细胞产生促进再生的生长因子。中性粒细胞还通过分泌趋化因子招募辅助性T细胞1型（T helper type 1, Th1）和Th17细胞，而巨噬细胞来源细胞因子则支持其中性粒细胞募集与存活。

在不同小鼠感染模型中，中性粒细胞的作用具有明显情境依赖性。真皮内感染时，中性粒细胞对细菌清除至关重要，这一过程依赖白细胞介素-1受体（IL-1 receptor）/髓样分化因子88（MyD88）信号及γδ T细胞产生的IL-17。角质形成细胞还可促使中性粒细胞产生IL-1β和CXCL2，从而放大募集并增强依赖NADPH oxidase的吞噬杀菌。此外，中性粒细胞可迁移至皮肤引流淋巴结，限制S aureus系统播散并支持淋巴细胞增殖。表皮感染模型中，中性粒细胞耗竭虽可减轻临床严重度，却不降低皮肤总菌负荷，反而促进细菌穿透真皮，说明其关键作用在于将感染限制于表浅表皮层。总体而言，中性粒细胞通过与上皮及免疫细胞的协同作用，在限制S aureus定植、组织侵袭及系统扩散方面居于核心地位。

Role of Neutrophils and Nets in Inflammatory Skin Diseases

有效的中性粒细胞功能依赖于浸润、活化及清除过程的严格调控。若炎症部位中性粒细胞清除不及时，则失调的中性粒细胞活化和过量NETs形成会参与多种炎症性及自身免疫性皮肤病的发病。在AD模型中，中性粒细胞产生升高的白三烯B₄（leukotriene B₄, LTB₄），可进一步募集中性粒细胞和CD4⁺ T细胞并放大过敏性炎症；同时，中性粒细胞分泌CXCL10还可驱动瘙痒。在银屑病中，循环NETosis中性粒细胞增加且与疾病严重程度相关；NETs可通过TLR4/IL-36R-MyD88-NFκB信号激活角质形成细胞，诱导脂质运载蛋白2（LCN2）分泌并持续募集更多中性粒细胞，形成自我维持的炎症环路。持续存在的中性粒细胞还会增强角质形成细胞促炎分子生成并降低丝聚蛋白（filaggrin）表达，从而损害屏障完整性。在脓疱型银屑病中，中性粒细胞来源IL-26可通过激活角质形成细胞炎症因子表达以及与共生菌DNA形成复合物激活TLR9，进一步加剧皮肤自炎症反应。于斑块型银屑病中，NETs还可通过干扰素基因刺激因子（STING）/NFκB信号诱导巨噬细胞产生IL-1β和IL-18。SLE中，NETs则作为自身抗原来源，促进抗DNA自身抗体形成，并与皮损及循环中的NETosis增强相一致。总体而言，过度中性粒细胞活化及NETs形成是多类皮肤疾病慢性炎症和组织病理损伤的重要驱动因素。

Enhanced presence of neutrophils contributes to enhanced S aureus skin colonization

尽管中性粒细胞是抵御S aureus皮肤感染的关键，但越来越多证据表明，中性粒细胞活性增强与S aureus皮肤定植之间存在复杂关系。在AD中，IL-8和GM-CSF等中性粒细胞趋化因子表达升高，与真皮中性粒细胞浸润增强及病变皮肤S aureus定植增加相关。丝聚蛋白缺失可诱导IL-8上调并促进S aureus定植，进一步支持“屏障受损-中性粒细胞炎症-细菌定植”之间的联系。

机械性破坏屏障后，S aureus在体内更易持续存在，这部分由浸润中性粒细胞形成的NETs与角质形成细胞相互作用所介导。募集到受损皮肤的中性粒细胞在遇到S aureus时更易发生NET形成，而NETs又刺激角质形成细胞释放HMGB1。HMGB1作为一种DAMP，可损伤屏障完整性并增强S aureus对人原代角质形成细胞及皮肤离体组织的黏附，由此形成促进进一步定植的正反馈回路。某些S aureus菌株还可诱导缺乏抗菌活性的NETs，这类NETs可能无法有效清除细菌，却会促进屏障损伤，进一步有利于细菌定植。

在SLE中，表皮暴露于S aureus也可诱导NET形成，并可能触发类似于疾病中所见的自身抗体生成。I型IFN被认为通过破坏表皮屏障促进S aureus定植，而NETs本身又是I型IFN的重要诱导因素，例如通过氧化线粒体DNA发挥作用，因此可能进一步加重屏障损伤并增强细菌黏附。在慢性创面和化脓性汗腺炎中，NETs与S aureus共存也可能构成促进组织损伤与延迟修复的病理环境。由此可见，中性粒细胞除抗菌作用外，还可能通过NET介导的屏障破坏悖论性地促进S aureus定植，并在易感个体中推动慢性炎症甚至自身免疫反应。

S aureus strategies to evade neutrophil killing

S aureus已进化出多种逃逸中性粒细胞杀伤的机制，且这种能力在AD病灶富集的高毒力菌株中尤为显著。其一，细菌可分泌趋化抑制蛋白，阻断C5a受体及甲酰肽受体信号，抑制中性粒细胞募集。其二，蛋白A（protein A, Spa）和凝集因子A（clumping factor A, ClfA）等表面相关蛋白可通过干扰调理吞噬削弱中性粒细胞介导的吞噬杀菌。其三，在吞噬体内，S aureus通过表达过氧化氢酶和超氧化物歧化酶中和ROS，并可诱导中性粒细胞产生衣康酸（itaconate）以抑制ROS生成，从而减弱氧化杀伤。

此外，S aureus还可通过降低菌体表面净负电荷抵抗阳离子AMPs。该过程依赖dlt介导的磷壁酸D-丙氨酸掺入及mprF介导的磷脂酰甘油L-赖氨酸化修饰，从而排斥阳离子抗菌分子。细胞外黏附蛋白（extracellular adherence protein, Eap）等蛋白酶抑制物还能抑制中性粒细胞丝氨酸蛋白酶，保护包括PSMs在内的关键毒力因子免于降解。S aureus还可借助白细胞毒素及PSMs等成孔毒素裂解吞噬体或中性粒细胞膜，逃逸至细胞外环境并加剧炎症。

在逃避NETs方面，虽然Spa和白细胞毒素LukAB等毒力因子可刺激NET形成，但S aureus同时通过核酸酶降解NETs的DNA骨架，避免被捕获和清除。其核酸酶可将NET DNA裂解为脱氧腺苷一磷酸，随后进一步转化为脱氧腺苷并诱导巨噬细胞凋亡，从而进一步削弱宿主免疫。ArlRS双组分调控系统则协调多种免疫逃逸因子的表达；缺失ArlRS的突变株表现出核酸酶表达下降、NET降解受损及关键毒素生成减弱，提示该通路在免疫逃逸中具有中心调控作用。

Therapeutic Insights and Future Directions

文章认为，尽管中性粒细胞是宿主防御的核心组成，但S aureus的免疫逃逸能力以及NETs介导的组织损伤提示，单纯增强中性粒细胞反应未必有利于控制定植。未来可利用肽基精氨酸脱亚氨酶4（peptidylarginine deiminase 4, PAD4）敲除小鼠等NET形成受损模型，解析NETs在炎症性皮肤中促进S aureus持续定植及调节免疫反应中的作用。同时，对临床分离株尤其是AD相关菌株的NET耐受谱进行比较，可能有助于明确菌株特异性的定植策略。

治疗上，靶向NET形成可能是在保留中性粒细胞其他抗菌机制前提下限制S aureus皮肤定植的可行方向。针对PAD4、MPO、中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase, NE）或ROS的抑制策略已在银屑病小鼠模型中显示效果，未来也可能用于限制AD中的S aureus定植和炎症。值得关注的是，NETs诱导的关键介质HMGB1已被证实与屏障破坏和S aureus定植增强相关，且其在AD病损中表达增加并发生胞质转位。抑制HMGB1信号可改善AD样表型，因此，靶向NETs-角质形成细胞相互作用及其下游HMGB1等效应分子，可能成为调控炎症并限制炎症性皮肤病中S aureus定植的有前景策略。