利用“化学位移平均”ZZ交换核磁共振（NMR）光谱技术评估蛋白质中天冬酰胺和谷氨酰胺侧链酰胺的受阻旋转速率

《Journal of Magnetic Resonance》：Evaluating the rate of hindered rotation of asparagine and glutamine side-chain amides in proteins using ‘chemical-shift-averaged’ ZZ-exchange NMR spectroscopy

　　维塔利·图加里诺夫（Vitali Tugarinov）| 托马斯·施密特（Thomas Schmidt）| 英芬法（Jinfa Ying）| G. 马里乌斯·克洛尔（G. Marius Clore）
美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）国家糖尿病、消化系统疾病和肾脏疾病研究所（National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases）化学物理实验室，贝塞斯达，马里兰州 20892-0520

**摘要**
本文描述了一种基于zz交换的核磁共振（NMR）方法，用于测量蛋白质中Asn/Gln侧链酰胺中NHD同位素异构体的受阻旋转速率（khrNHD）。该方法在两种模型蛋白——泛素（ubiquitin）和GB1的侧链NHD酰胺上进行了验证，这两种蛋白溶解在50% H2O/50% D2O的混合溶剂中，测试温度分别为25°C、30°C和35°C。结果表明，khrNHD的速率始终低于同一蛋白样本中侧链NH2酰胺（khrNH2）的速率，这反映了二级动力学同位素效应。两种速率的平均比值ρ = khrNH2/khrNHD（用于衡量这种效应的大小）在两种蛋白的Asn/Gln侧链酰胺中约为1.3，仅略高于模型化合物15N-甲酰胺的比值（1.15 ± 0.04）。对于两种通过氢键连接的侧链酰胺，观察到的比值ρ显著高于平均值。

**引言**
由于氮原子孤对电子向羰基π轨道的离域作用，导致一级酰胺基团围绕碳-氮（CN）键的旋转受到限制，从而使sp2杂化的CN键具有部分双键特性。关于受阻酰胺基团旋转的首次NMR研究可追溯到20世纪50年代中期[1]。许多化学化合物的CN键周围受阻旋转的动力学特性已被研究[2][3]。在蛋白质中，天冬酰胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）侧链的一级酰胺（NH2）基团的受阻旋转会导致两个质子（HE：反式/顺式相对于羰基氧；HZ：顺式/反式相对于羰基氧）的位置在室温下超过约100毫秒的时间尺度内发生交换。
Guenneugues等人[4]的早期研究使用同核2D（1H-1H）非共振ROESY实验来量化蛇毒α中Asn/Gln侧链NH2基团两个质子之间的交换速率。这种方法需要对对角线和非对角线交叉峰进行定量分析，但由于共振峰之间的严重重叠（尤其是对角线峰之间以及与NH2共振峰附近的其他峰之间的重叠）而受到限制。最近，Iwahara及其同事开发了一种2D（1H-1H）zz交换NMR实验[5]，其中通过过滤元件实现了属于NH2位点的峰的对角线和非对角线位置的交换（ODDS），显著减少了NH2对角线共振峰的重叠。这种选择性针对NH2的实验可以被认为是准确可靠地测量蛋白质中Asn/Gln侧链NH2基团受阻旋转速率的最先进NMR方法。

**本文描述了一种基于zz交换的简单NMR方法，用于测量溶解在50%/50%（体积比）H2O和D2O混合溶剂中的蛋白质中Asn/Gln侧链酰胺的NHD同位素异构体的受阻旋转速率（khrNHD）。这些速率与使用ODDS方法在同一蛋白样本中获得的完全质子化的（NH2）酰胺基团（khrNH2）的速率进行了比较。对于本研究中使用的两种模型蛋白——人泛素（8个NH2位点）和链球菌蛋白G的免疫球蛋白结合域B1（GB1；5个NH2位点）——在三种温度（25°C、30°C和35°C）下，khrNHD的速率始终低于khrNH2的速率，这反映了二级动力学同位素效应。这种效应的大小通过两种速率的比值ρ = khrNH2/khrNHD来表示，在蛋白质的Asn/Gln侧链中测得的该比值与用于研究一级酰胺中二级动力学同位素效应的模型化合物15N-甲酰胺的比值相当。**

**结果与讨论**
本研究的出发点是观察到两种部分氘代的酰胺基团——NHEDZ和NHZDE（氘原子分别位于Z位点和E位点）由于15N核的氘同位素位移不同而具有略微不同的15N化学位移。图1A显示了使用NHD同位素异构体选择记录的1H-15N HSQC谱中的Asn/Gln侧链NH2区域[6]（去除了完全质子化的NH2基团的信号）。

**结论**
我们描述了一种基于zz交换的NMR方法，用于测量溶解在H2O/D2O混合溶剂中的蛋白质中Asn/Gln侧链酰胺的NHD同位素异构体的受阻旋转速率（khrNHD）。该方法在两种模型蛋白——泛素和GB1的侧链NHD酰胺上进行了测试，测试温度为25°C、30°C和35°C。结果表明，khrNHD的速率始终低于同一NMR样本条件下测得的侧链NH2酰胺（khrNH2）的速率。

**作者贡献声明**
维塔利·图加里诺夫（Vitali Tugarinov）：概念构思、数据整理、形式分析、实验设计、方法开发、软件应用、验证、初稿撰写及审稿编辑。
托马斯·施密特（Thomas Schmidt）：数据整理、实验设计、方法开发、撰写及审稿编辑。
英芬法（Jinfa Ying）：数据整理、形式分析、方法开发、软件应用、撰写及审稿编辑。
G. 马里乌斯·克洛尔（G. Marius Clore）：资金获取、项目管理、资源协调、监督指导、撰写及审稿编辑。

**利益冲突声明**
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

**致谢**
我们感谢NIDDK（美国国立卫生研究院）的James Baber博士和Dan Garrett博士提供的技术支持，以及Ad Bax博士的有益讨论。本研究得到了美国国立卫生研究院下属的国家糖尿病、消化系统疾病和肾脏疾病研究所（NIDDK）内部项目的支持（资助编号DK029023，授予G.M.C.）。NIH作者的贡献被视为美国政府的工作成果。本文中的发现和结论仅代表作者本人，并不代表任何其他机构或组织的观点。