《British Journal of Pharmacology》：Priming with interleukin-1α and chemical hypoxia modulates the mesenchymal stem cell secretome to dampen microglial inflammation and promote neuroprotection
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背景与目的：研究人员假设，使用白细胞介素-1α（IL-1α）与CoCl?（一种低氧模拟物）对人骨髓来源的间充质干细胞（hBMSCs）进行双重预处理，将能够调控其在低氧-缺血条件下的治疗效果。
实验方法：研究人员对hBMSCs进行单独或联合预处理。为验证其抗炎
背景与目的：研究人员假设，使用白细胞介素-1α（IL-1α）与CoCl?（一种低氧模拟物）对人骨髓来源的间充质干细胞（hBMSCs）进行双重预处理，将能够调控其在低氧-缺血条件下的治疗效果。
实验方法：研究人员对hBMSCs进行单独或联合预处理。为验证其抗炎与细胞保护特性，将预处理hBMSCs来源的条件培养基（CM）应用于脂多糖（LPS）处理的BV2小胶质细胞（炎症模型）以及暴露于氧糖剥夺（OGD）的BV2细胞（低氧损伤模型）。神经保护效应通过评估在氧糖剥夺/复氧（OGD/R）条件下，于各种CM存在时神经元样细胞（NLCs）的死亡情况来评价。
主要结果：预处理显著改变了hBMSCs的分泌谱。IL-1α触发了炎性介质/细胞因子的显著释放（P < 0.05），尤其是肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）。除G-CSF外，双因素预处理并未增强这些分子的释放。虽然单独使用IL-1α或低氧模拟物预处理未能诱导神经营养因子β-神经生长因子（β-NGF）和脑源性神经营养因子（BDNF）的显著分泌，但双因素预处理导致这些神经营养因子的分泌显著增加（P < 0.05）。
在LPS模型中，双因素预处理hBMSCs来源的CM显著减少了促炎细胞因子TNF-α和IL-6的分泌。在OGD/R模型中，预处理对促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的显著降低（P < 0.05）无显著影响。最后，预处理hBMSCs来源的CM减少了神经元细胞毒性，但仅双因素预处理hBMSCs来源的CM在OGD/R后显著（P < 0.05）恢复了NLCs的代谢活性。
结论与意义：这些发现突显了双因素预处理作为优化MSC基方法以应对低氧-缺血条件的前景广阔的策略。
缺血性卒中（ischaemic stroke, IS）是全球性的重大健康挑战，其病理特征表现为严重的低氧环境和显著的神经炎症反应。尽管间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）在再生医学领域展现出巨大潜力，但其在临床应用中的疗效往往受到缺血性脑组织恶劣微环境的制约，包括炎症反应剧烈、细胞定植困难、移植后早期清除以及解冻后功能恢复延迟等问题。鉴于MSCs的治疗效应主要依赖于其旁分泌信号分子组成的分泌组（secretome），而非细胞本身的分化能力，研究人员将目光转向无细胞治疗策略，即利用MSCs来源的条件培养基（conditioned medium, CM）或纯化分泌组进行干预。与单一生物活性分子相比，CM包含多种能够同时靶向多条病理生理通路的生物分子，对于应对缺血性卒中复杂的病理过程具有独特优势。为进一步增强MSCs及其分泌组的治疗潜能，预处理（priming）策略被广泛探索，即通过低剂量、非损伤性的应激因子（如炎性细胞因子、低氧环境等）"免疫"MSCs，使其更好地适应挑战性环境。然而，尽管炎性细胞因子预处理和低氧预处理均已被独立证实可增强MSCs的治疗特性，但联合应用这些刺激的潜在协同效应尚不明确。基于此，本研究旨在探究IL-1α与低氧模拟物双因素预处理对人骨髓来源MSCs（hBMSCs）分泌组的影响，以期为缺血性卒中的无细胞治疗提供优化策略。该论文发表在《British Journal of Pharmacology》。
研究中使用的关键技术方法包括：人骨髓来源MSCs（购自3H Biomedical，来源于22周龄胎儿，培养 passages 4–6）、小鼠小胶质细胞BV2细胞系（ATCC）、人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞来源的神经元样细胞（NLCs，经维甲酸和BDNF分化处理）；预处理方案包括10 ng/mL IL-1α、100 μM CoCl?（低氧模拟物）单独或联合处理24小时；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）定量检测分泌蛋白；流式细胞术评估细胞活力；乳酸脱氢酶（LDH）释放实验和MTT比色法（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）分别检测细胞膜完整性和代谢活性；免疫细胞化学方法检测基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的亚细胞定位。
研究结果显示以下几个主要发现：
**CoCl?诱导低氧模拟信号并差异调节HIF-1α亚细胞定位与VEGF分泌**：CoCl?以浓度依赖性方式显著增加hBMSCs的血管内皮生长因子（VEGF）分泌（P < 0.05），100 μM浓度在4小时时诱导低氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α）显著核转位，核质比最高，而VEGF分泌随处理时间延长持续增加。
**双因素预处理hBMSCs分泌更多神经营养因子**：预处理显著改变hBMSCs分泌谱。IL-1α单独预处理显著增加G-CSF、TNF-α和ICAM-1水平（P < 0.05）；双因素预处理使G-CSF分泌量翻倍，但未进一步增强TNF-α和ICAM-1。值得注意的是，虽然单独IL-1α或低氧预处理未显著改变β-NGF和BDNF分泌，但双因素预处理使这两种神经营养因子分泌显著增加约2倍（P < 0.05）。双向方差分析显示两种预处理刺激对TNF-α和ICAM-1存在显著交互作用，低氧预处理减弱了IL-1α诱导的促炎反应。
**双因素预处理hBMSCs来源CM抑制LPS处理小胶质细胞的促炎细胞因子产生**：在LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症模型中，各组CM均抑制促炎细胞因子产生。双因素预处理CM使TNF-α和IL-6产生进一步降低，较单纯LPS组降低约2倍；与未预处理CM相比，双因素预处理CM使IL-6和TNF-α分泌分别显著降低1.8倍和约2倍（P < 0.05），同时使IL-10产生增加约3倍。
**预处理hBMSCs来源CM调节OGD/R暴露小胶质细胞的免疫与细胞毒性特征**：在氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型中，各组CM均显著降低IL-6和IL-1β水平（P < 0.05）；双因素预处理CM使IL-6降低幅度最大（4.2倍）。IL-1α预处理CM使IL-10分泌显著增加3.4倍。双因素预处理CM在免疫调节综合评分上表现最优（P < 0.05）。LDH检测表明双因素预处理CM显著减少细胞膜损伤（P < 0.05），但流式细胞术显示各组细胞死亡比例差异较小。
**预处理hBMSCs来源CM降低OGD/R暴露小胶质细胞MMP-9表达**：OGD/R显著诱导BV2细胞核与胞质内MMP-9表达（P < 0.05），各组CM均显著降低其表达，其中低氧预处理CM效果最显著（约2倍降低），但培养上清中MMP-9总量无显著变化。
**双因素预处理hBMSCs来源CM对OGD/R暴露神经元样细胞的神经保护作用**：在NLCs的OGD/R模型中，所有CM均降低复氧诱导的LDH释放；仅双因素预处理CM显著恢复细胞代谢活性（P < 0.05），表现出最强的代谢 rescue 效应。
讨论部分指出，缺血性卒中后神经元坏死触发以微胶质细胞激活为主的促炎级联反应。本研究证实双因素预处理策略——依次暴露hBMSCs于低氧模拟物和IL-1α刺激——能够有效调控其分泌组的治疗潜能，使其向神经保护和免疫调节表型转变。双因素预处理优化了MSC分泌组，增加了β-NGF、BDNF和G-CSF等关键神经营养因子的分泌，这些分子通过抗凋亡信号、血管生成支持、促进神经可塑性和轴突萌发等机制发挥神经保护作用。研究还发现双因素预处理产生"中等"水平的ICAM-1，既有利于细胞迁移又避免过度炎症。尽管预处理hBMSCs分泌TNF-α增加，但其与VEGF、β-NGF和BDNF升高及小胶质细胞炎症激活降低相伴随，提示该情境下TNF-α信号可能参与协调神经保护反应而非单纯促炎。在免疫调节方面，CM治疗降低促炎细胞因子、增加IL-10分泌的效果具有通路特异性而非全局性抑制；对MMP-9的调控主要在于细胞内表达而非分泌，提示可能有助于保护血脑屏障完整性。值得注意的是，低氧单独预处理CM在流式细胞术检测中表现出增加细胞毒性的趋势，凸显了优化预处理条件的重要性。研究局限性在于仅使用二维单层细胞培养模型，未来需在神经元-微胶质细胞-星形胶质细胞共培养体系及体内卒中模型中进一步验证。
研究结论：该研究证实，使用低氧模拟物和IL-1α预处理hBMSCs可通过选择性调控hBMSC表型来改变其分泌组，产生更具神经营养和免疫调节特性的旁分泌谱。该方法增加了抗炎细胞因子和关键神经营养因子的分泌，可能为优化卒中的MSC基治疗提供策略。
