《British Journal of Pharmacology》：Multivalent antibody-based conjugates as new tools for tailored modulation of G protein–coupled receptors
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G蛋白偶联受体（G protein–coupled receptor，GPCR）超家族是目前已获批药物中占比最高的靶点类型，靶向GPCR为治疗开发提供了极具吸引力的路径。抗体及其片段（如单域抗体，又称纳米抗体、VHH）已成为小分子药效团的重要替代方案，作为多价
G蛋白偶联受体（G protein–coupled receptor，GPCR）超家族是目前已获批药物中占比最高的靶点类型，靶向GPCR为治疗开发提供了极具吸引力的路径。抗体及其片段（如单域抗体，又称纳米抗体、VHH）已成为小分子药效团的重要替代方案，作为多价偶联物的构建单元发挥作用。抗体与纳米抗体通过结合界面实现高亲和力与高特异性识别，可结合小分子难以靶向的GPCR表位。其中纳米抗体已被证实可作为稳定或选择性识别GPCR构象的工具，应用于结构生物学或生物传感领域。本综述聚焦于抗体与纳米抗体在多价偶联物中的应用，这类偶联物可实现目标GPCR的高效特异性激活、优先结合受体组装体，并诱导定制化的偏向性药理响应。文中汇总了多肽-抗体构建体、纳米抗体-纳米抗体融合物、小分子-纳米抗体偶联物三类案例的研究进展，并进一步讨论了新兴生物偶联策略与抗体工程平台将如何拓展多价生物偶联物作为下一代GPCR治疗剂的实用价值。
1 引言
G蛋白偶联受体（GPCR）是人类基因组中规模最大、功能最多样的蛋白家族之一，约35%的FDA获批治疗药物以GPCR为靶点，凸显其在生理与疾病中的核心作用。GPCR功能研究依赖可选择性激活或阻断受体活性的配体，但内源性配体普遍存在泛素性，单个化合物可结合多个GPCR亚型并启动多条信号通路，限制了其在机制研究与药物开发中的应用。GPCR药理学长期面临的核心挑战之一是缺乏具备足够亚型选择性的配体。传统GPCR靶向配体多结合正构位点，该位点位于受体跨膜区，在不同GPCR家族间高度保守，导致高选择性配体的开发难度极大；变构位点虽进化分歧度高、有望提升亚型选择性，但受限于结构与空间信息不足，开发进展受限。随着受体药理学研究的深入，新的特异性挑战逐渐显现：单个受体在不同组织中表达时可介导不同的生理响应，同一细胞内常共表达多种GPCR且信号网络存在动态互作，GPCR还可与其他膜蛋白形成寡聚复合物以调控功能。针对这些多层次受体组织模式的靶向策略为治疗选择性提供了新的开发方向，推动了多价配体的发展——通过共价连接两个或多个药效团，同时结合同一受体或受体复合物中不同的结合位点。多价配体的设计理念已有四十余年历史，近年相关研究持续拓展与多元化。
2 利用多价化合物靶向单个受体与受体复合物
2.1 多价化合物的分类
多价靶向是指通过化合物同时结合受体的多个结合位点，最常见形式为双价配体，即两个药效团通过连接子共价连接。若两个药效团相同则为同双价配体，不同则为异双价配体。异双价配体可能出现钩效应：高浓度配体、连接子长度或几何构型不适宜时，无法同时结合两个位点，每个药效团独立结合各自的受体。因此优化连接子设计、药效团空间取向与受体拓扑结构对避免该效应至关重要。本研究明确区分双价化合物与双位点配体：双价化合物的两个药效团均靶向GPCR正构位点；双位点配体中至少一个药效团靶向非正构位点。后者进一步分为顺式双位点配体与反式双位点配体：顺式双位点配体同时结合单个受体分子的正构位点与次级（变构）位点；反式双位点配体结合一个受体分子的正构位点与另一个受体分子的二级位点。这类结合模式可利用双价结合的热力学与动力学优势，实现对受体对的优先结合，优于单体结合。
2.2 小分子多价配体在GPCR靶向中的应用与经验
小分子双价与双位点配体已积累了大量研究证据。顺式双位点配体适用于次级变构位点可及且与正构位点空间邻近的场景，毒蕈碱乙酰胆碱受体家族是典型代表——其变构位点位于受体胞外表面且结构明确，已有多个成熟的正构与变构配体可用于双位点设计。例如靶向毒蕈碱M2受体的双位点配体THRX-160209，亲和力较其组成的正构与变构单元显著提升；另一由毒蕈碱受体正构配体iperoxo与正向变构调节剂连接的双位点配体，意外表现出对M2/M4亚型的特异性。上述案例证明靶向变构位点的双位点配体可提升亚型选择性与结合亲和力。
双位点配体实现双位点结合受连接子设计影响显著。腺苷A1受体的研究显示，双位点配体的结合可被单体变构药效团竞争，提示配体可能未同时占据两个位点，而是在两个位点间切换，单体结合可竞争性取代双位点结合并加速解离，这与连接子长度不足直接相关。5-羟色胺（5-HT）GPCR组装体的研究中，双价拮抗剂偶联物的活性随连接子长度变化，中等长度连接子活性最高；多巴胺受体双位点配体的活性受连接子立体化学与组成的调控；刚性寡脯氨酸连接子可通过几何约束促进两个胃泌素释放肽受体原体的双位点结合，改变信号特征；μ阿片受体双位点配体在几何约束匹配时，可表现出强效的通路选择性信号（偏向性激动）。反式双位点配体可优先结合共表达的受体对，例如靶向大麻素CB1受体与μ阿片受体对的双位点配体，可在单细胞表面桥接两种受体原体；靶向多巴胺D3受体与神经降压素NTS1受体的双位点配体，对D3–NTS1受体异源二聚体的结合偏好显著高于D2–NTS1异源二聚体，还可诱导D3受体的内化，这是单价配体无法实现的功能。这些发现明确了空间约束、亲合力效应与结合位点要求对多价配体设计的重要性，为后续整合生物来源结合元件的多价设计提供了参考。
3 利用生物制剂来源的双位点偶联物拓展靶向范围
3.1 用于GPCR靶向的抗体支架
尽管小分子双位点配体已取得进展，但多数GPCR的次级结合位点尚未被充分表征，限制了该类配体的开发。生物亲和试剂可结合小分子难以靶向的蛋白表面，为多价与双位点受体配体的设计提供了新路径。生物制剂具备模块化、高特异性与靶向独特胞外表位的能力，是理想的GPCR靶向支架。
抗体是最成熟的生物制剂类型，对膜蛋白的胞外暴露表位具备极高的亲和力与特异性，还拥有较长的循环半衰期与优良的药代动力学特征，已在肿瘤、免疫与感染性疾病治疗中广泛应用。目前已有抗体通过结合并中和GPCR配体（如降钙素基因相关肽用于治疗偏头痛）进入临床应用，少数直接结合GPCR的抗体已进入临床评估或获批，但多数不直接调控受体功能，而是作为多特异性构建体的组成部分。常规抗体直接调控GPCR功能的难度较高：多数GPCR仅暴露较短的胞外片段作为表位，仅B类（分泌素家族）与C类GPCR拥有较大的胞外域可供抗体结合；且多数GPCR的正构位点位于跨膜区，抗体通过其分散的结合界面（互补位）难以接近这类位点。为突破这一限制，研究者开发了替代支架，其中单域抗体（纳米抗体、Nb）研究最为深入。纳米抗体源自骆驼科动物重链抗体的可变区，分子量仅约15 kDa，保留了抗体的高亲和力与高特异性，且CDR3环更长、结构多样性更高，可形成凸面互补位，结合常规抗体难以接近的凹陷或埋藏表位（包括正构配体结合口袋）。纳米抗体常被用于稳定GPCR的特定构象状态，应用于受体激活动态监测与结构生物学研究，也可通过CDR1与CDR2环结合受体胞外区，形成广泛的分子间相互作用。与常规抗体相比，纳米抗体由单一开放阅读框编码，可在原核与真核系统中高效表达，无需轻重链配对与糖基化修饰，便于通过基因融合或化学标记与药理探针、多肽或化疗弹头连接，为定制化GPCR靶向多价偶联物的构建提供了灵活的平台。
3.2 偶联化学：生物制剂与生物活性合成分子的连接
多数靶向GPCR的抗体与纳米抗体本身不具备信号调控活性，因此开发将抗体与生物活性分子连接的稳健方法，是将受体结合抗体转化为可调信号配体的核心。生物偶联指将一个生物分子与另一个功能实体共价连接以生成杂合偶联物的过程，设计需综合考虑抗体/纳米抗体结合单元、配体部分的组成与特性、连接子的长度与化学性质、连接位点等变量，这些参数会显著影响偶联物的信号效力、受体选择性、治疗效果与其他药理属性。
3.2.1 生物制剂与生物活性配体的基因融合
基因融合是通过合成编码融合蛋白的DNA并进行重组表达，直接构建细胞表面受体靶向生物偶联物的策略，仅适用于靶受体可被基因编码的多肽或蛋白激活的场景。该方法概念简单，但融合蛋白常存在稳定性或折叠效率下降的问题，需大量优化。例如将靶向PCSK9的IgG与GLP-1受体多肽激动剂融合，需精细工程改造才能获得稳定的功能性产物。此外基因融合仅能使用天然编码氨基酸，难以引入C端酰胺化、特殊环化化学或非天然残基等提升多肽稳定性的修饰，限制了其在依赖这类修饰的生物活性肽偶联物中的应用。
3.2.2 化学与位点特异性偶联策略
基因融合的局限性推动了可整合化学合成组分的偶联策略的发展。常规抗体含有大量赖氨酸、半胱氨酸等具有亲核侧链的残基，可用于化学修饰，早期策略通过N-羟基琥珀酰亚胺酯酰化赖氨酸、马来酰亚胺标记还原的半胱氨酸巯基实现偶联。但这类随机偶联会产生异质性产物混合物，导致药理表征困难、偶联物聚集沉淀、体内性能下降。例如随机标记的靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的纳米抗体在体内会出现非特异性蓄积，而位点特异性标记可提升肿瘤摄取与生物分布特性。随机标记高分子量配体（如GPCR肽类配体）尤其容易产生高度异质性的混合物并引发聚集。
为解决这一问题，位点特异性偶联化学得到快速发展。一种常用策略是引入不参与二硫键形成的非天然半胱氨酸，利用马来酰亚胺或α-卤代羰基衍生物与其形成硫醚键实现标记。另一种策略是通过终止密码子抑制技术，将叠氮苯丙氨酸、乙酰苯丙氨酸等非天然氨基酸定点引入蛋白，用于后续的位点特异性连接。此外酶促标记也是重要的位点特异性修饰手段，通过在目标蛋白上融合肽标签，利用甲酰甘氨酸生成酶、转谷氨酰胺酶、分选酶A（Sortase A，SrtA）等酶的特异性识别与修饰，实现生物活性分子或化学标签的定点安装。其中分选酶A因操作简单、不干扰蛋白结构与结合活性，被广泛用于GPCR靶向双位点偶联物的构建，可识别LPXTG肽基序，切割苏氨酸与甘氨酸之间的肽键形成硫酯中间体，再与寡甘氨酸功能化的伙伴发生亲核取代，形成新的酰胺键。
3.2.3 生物正交与化学选择性化学
上述标记技术常不直接连接生物活性配体，而是先引入可用于后续化学选择性反应的基团。生物正交化学指两个基团之间可发生相互反应，且与生物体系中天然存在的官能团无交叉反应的化学过程，是连接多个生物分子的高效工具。代表性反应包括铜催化叠氮-炔烃环加成（CuAAC）与无金属应变促进叠氮-炔烃环加成（SPAAC，即点击化学）、四嗪-反式环辛烯环加成、肟与腙的形成、Staudinger连接、硫-氟交换（SuFEx）化学等。这类反应可在温和的水相条件下快速高效进行，还可用于在目标生物场景中按需生成偶联物。目前已报道的抗体或纳米抗体来源的多价GPCR靶向偶联物可分为三类：肽类-生物制剂偶联物（如靶向GLP-1受体/GIP受体的AbGIPR–GLP1、靶向甲状旁腺激素1型受体（PTHR1）的NbPTHR1–PTH(1–14)、靶向神经激肽1受体的Nb-NKA、靶向血管紧张素II AT1受体的Nb6E-AngII等）、小分子双位点偶联物（如靶向腺苷A2A受体的Nb–CGS）、双位点纳米抗体-纳米抗体生物偶联物（如靶向代谢型谷氨酸受体2（mGlu2）的双互补位纳米抗体二聚体DN13–DN1、靶向趋化因子受体CXCR2的双互补位纳米抗体二聚体Nb127D1–Nb163E3、靶向CXCR4的双互补位纳米抗体二聚体238D2-238D4等）。
4 生物制剂来源的双位点GPCR靶向案例研究
4.1 肽类-生物制剂偶联物
4.1.1 甲状旁腺激素1型受体（PTH1受体）
PTH1受体是典型的B类GPCR，通过双位点机制结合配体：胞外域（ECD）介导高亲和力配体结合但不直接参与信号启动，配体与跨膜域（TMD）的相互作用亲和力较低但对信号转导至关重要。PTH1受体较大的ECD是理想的抗体或纳米抗体锚定位点。研究人员通过免疫获得了结合PTH1受体ECD且不具内在信号活性的纳米抗体，将其与低效力的PTH(1–11)或PTH(1–14)配体通过酶促标记与点击化学定点连接，所得偶联物对PTH1受体的效力较游离配体提升超过1000倍，且对PTH1受体的选择性显著高于游离PTH(1–34)。机制研究显示，这类偶联物可同时结合两个共表达的PTH1受体原体，实现反式激活；药理学表征表明，Nb–PTH(1–11)偶联物可强效激活Gαs通路产生cAMP，但几乎不招募β-抑制蛋白、不激活Gαq通路、不诱导受体内化，是目前报道的选择性最高的PTH1受体偏向性激动剂，有望在避免脱靶副作用的前提下实现治疗获益。
4.1.2 胰高血糖素样肽1受体（GLP-1受体）与葡萄糖依赖性促胰岛素多肽受体（GIP受体）
GLP-1受体与GIP受体是B类GPCR，其激动剂是治疗2型糖尿病与肥胖的热门靶点。研究发现同时激动GLP-1受体与拮抗GIP受体可产生更强的减重效果。研究人员将GIP受体拮抗抗体突变引入游离半胱氨酸，再与含非天然氨基酸Aib（提升稳定性）的化学合成GLP-1类似物通过半胱氨酸-亲电试剂反应连接，得到偶联物AMG133（AbGIPR–GLP1）。该偶联物在GIP受体表达细胞中表现为拮抗剂活性，在GLP-1受体表达细胞中表现为激动剂活性；在两种受体共表达的细胞中，偶联物的cAMP产生效力显著高于单独GLP-1肽，且可促进两种受体的β-抑制蛋白招募与内化，内吞信号对该偶联物的活性至关重要。体内实验显示，该偶联物较单独的GIP受体抗体或GLP-1肽可显著降低小鼠与非人灵长类动物的体重，且可富集于胰腺、肝脏等组织，提示组织特异性受体结合是其高效性的重要原因。此外还有研究构建了仅靶向GLP-1受体的纳米抗体-肽偶联物，同样表现出强效Gαs通路激活与极低的β-抑制蛋白招募特征，证明生物制剂-肽偶联物可拓展肠促胰岛素受体配体的药理特性空间。
4.1.3 神经激肽1受体（NK1受体）
NK1受体是A类GPCR，目前尚无直接靶向野生型受体的纳米抗体。研究人员通过在受体N端串联三个正交表位标签（6E、Alfa、BC2），获得可被对应纳米抗体识别的工程化受体，再将靶向各表位的纳米抗体与NK1受体肽激动剂NKA或SP6-11通过分选酶介导的连接构建偶联物。这类偶联物对不同信号通路（Gαs、Gαq、β-抑制蛋白招募）的激活效力存在差异，多数偶联物对Gαs通路的cAMP产生最大效应低于游离配体，但信号持续时间更长，转录输出更强；对Gαq通路与β-抑制蛋白招募则多表现为完全激动活性，活性差异可能与纳米抗体表位在受体N端的位置有关。
4.1.4 血管紧张素II AT1受体
目前已获得的AT1受体纳米抗体均为拮抗剂，不利于构建激动型偶联物。研究人员通过在AT1受体N端引入6E表位标签，将靶向6E的纳米抗体与血管紧张素II、TRV027、TRV055、TRV056等功能各异的肽配体连接，所得偶联物对Gαq与β-抑制蛋白招募的效力均较游离配体提升，但仅部分偶联物表现出显著的Gαq通路偏向性。放射性配体竞争实验显示，优化的双位点偶联物在饱和浓度下仅可置换约20%的放射性正构配体，却仍可启动完整的下游信号，提示纳米抗体的高亲和力结合可能限制了连接配体对正构口袋的完全占据，使配体采取非经典的结合模式，这可能是其特殊药理特征的来源。
4.2 小分子双位点偶联物
4.2.1 腺苷A2A受体
多数GPCR的配体为小分子而非肽类，构建抗体或小分子偶联物需开发不降低小分子活性的定制化连接化学。研究人员选择A2A受体激动剂CGS21680作为小分子模块，利用其伸出受体胞外前庭的羧基作为连接位点，通过点击化学与靶向受体N端表位标签的纳米抗体连接，所得偶联物仅对携带对应表位标签的A2A受体变体具有强效选择性激活作用，且cAMP信号持续时间显著长于游离CGS，证明纳米抗体-小分子偶联物可实现GPCR的强效、选择性、长效调控。
4.3 双位点纳米抗体-纳米抗体生物偶联物
4.3.1 代谢型谷氨酸受体（mGluRs）
mGlu受体是C类GPCR，与多种神经精神疾病相关。研究人员将靶向mGlu2受体不同位点的两个纳米抗体（中性结合剂DN1与正向变构调节剂DN13）通过基因融合构建双位点纳米抗体构建体DN13–DN1，其对mGlu2受体的结合能力与正向变构调节活性均显著高于单价DN13，在NMDA受体功能低下与精神分裂症小鼠模型中，单次给药可恢复认知功能长达7天，远优于小分子对照。该构建体尺寸较小，可穿透血脑屏障发挥中枢作用，而尺寸更大的DN13-Fc融合蛋白虽在细胞实验中活性相当，但体内无行为学改善效果，证明尺寸是中枢靶向纳米抗体偶联物的重要设计参数。
4.3.2 趋化因子受体CXCR2
趋化因子受体系统存在高度冗余与简并性，难以开发高选择性治疗药物。研究人员针对CXCR2的N端区域与跨膜区胞外环分别获得了两类纳米抗体，将来自两类的纳米抗体融合为双互补位构建体127D1-163E3，其抑制活性显著高于单价纳米抗体或同类别双价构建体。机制研究表明该构建体可桥接相邻的两个CXCR2受体原体，实现反式结合，提升了靶向特异性。类似策略也已成功应用于CXCR4等其他趋化因子受体的调控。
5 拓展可及靶点的新工具：纳米抗体的发现、设计与工程
目前仅有少量GPCR拥有已验证的纳米抗体结合剂，且多靶向胞内表位，难以用于构建双位点偶联物。传统纳米抗体开发依赖骆驼科动物免疫，周期长、成本高、存在动物伦理问题，且难以针对与宿主蛋白同源性高的抗原获得结合剂。体外合成发现平台可解决这些问题：合成纳米抗体库包含预设的纳米抗体序列库，可设计引入延长CDR等结构元件以靶向凹陷表位，已成功获得多个难靶向GPCR的纳米抗体。此外计算设计与筛选技术的发展也为纳米抗体开发提供了新路径：早期研究采用CDR环移植技术，将现有抗体的CDR移植到纳米抗体支架上探索新的结合界面；随后对接算法被用于预测结合界面的互补性与稳定性；近年来AlphaFold、RoseTTAFold等深度学习结构预测工具与RFdiffusion等生成式设计引擎结合，已实现针对MRGPRX1、CXCR4、GLP-1受体、GIP受体等GPCR的纳摩尔级亲和力纳米抗体的从头设计，弥补了合成库与展示技术的不足，拓展了下一代双位点GPCR偶联物的工程工具箱。
6 结论、挑战与未来方向
整合抗体或其他生物亲和试剂的多价偶联物相较小分子策略具备多项优势：模块化结构便于通过基因融合或位点特异性标记工程化构建，实现高选择性受体结合；连接子的组成与长度耐受性优于小分子多价化合物；可优先靶向受体组装体而非单个受体组分，实现依赖受体共表达的“逻辑门”信号调控，有望将广泛表达的受体靶向至特定细胞类型或组织（如肿瘤微环境），减少脱靶副作用。纳米抗体偶联物的小尺寸、亲合力效应与可调连接化学有利于提升组织穿透能力，延长小分子配体的血液循环时间。
这类设计原则还可拓展至受体激活或阻断之外的功能：例如构建靶向GPCR的降解或重新定位偶联物，通过同时靶向GPCR与膜相关E3连接酶或组成型内吞受体，清除病理状态下具有组成型活性的受体；或构建双特异性T细胞或NK细胞衔接器，特异性靶向疾病部位的GPCR表达细胞。
多价生物偶联物的临床转化仍面临实际挑战：纳米抗体等小尺寸抗体片段会被肾脏快速清除，可通过PEG修饰或与血清白蛋白结合单元连接延长循环时间；多数生物偶联物难以穿透血脑屏障，可与转铁蛋白受体等内源性转运体结合单元连接，实现中枢递送。随着这些问题的解决，抗体来源的生物偶联物将成为超越传统受体激活或阻断的、机制驱动的GPCR功能调控新工具与临床候选药物。
