Thiamet G对O-乙酰氨基葡萄糖苷酶（O-GlcNAcase, OGA）的抑制在计算机中破坏胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）分泌组的血管基质（AngioMatrix）特征并在体外损伤其血管生成能力

《Journal of Molecular Biology》：The O?GlcNAcase inhibition by Thiamet G disrupts the AngioMatrix signature of the Glioblastoma secretome in silico and impairs its angiogenic capacity in vitro

　　

本研究旨在探究O-乙酰氨基葡萄糖苷酶（O-GlcNAcase, OGA）抑制剂Thiamet G（TMG）在调控胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）分泌组血管生成能力方面的潜在作用。研究人员采用无标记质谱技术（label-free mass spectrometry）结合体外验证实验，对TMG处理后的U87-MG GBM细胞分泌组进行了系统分析。计算机模拟分析（in silico analysis）显示，TMG处理使GBM分泌组中富集了与血管生成生物学过程相关的细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）通路，即"血管基质"（AngioMatrix）特征，同时伴有血栓反应蛋白-2（Thrombospondin-2, THBS2）、C-C基序趋化因子2（C-C motif chemokine 2, CCL2）和白细胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）的显著变化。其中，仅THBS2基因改变和CCL2基因表达与GBM患者总生存期显著相关。进一步的体外验证实验表明，将内皮细胞暴露于TMG处理的GBM分泌组后，其出现了异常的管腔形成（tubulogenesis）和迁移障碍，提示TMG处理GBM细胞在功能上破坏了肿瘤细胞调控血管生成相关过程的能力。这些开创性结果首次证实了TMG对GBM分泌组AngioMatrix特征的影响，将OGA活性的药理学抑制与GBM抗血管生成治疗的创新策略相联系。

胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）是中枢神经系统中最具侵袭性的肿瘤，标准治疗方案仍局限于最大限度的手术切除联合化疗和放疗，患者平均生存期仅15个月，且75-90%的患者会出现复发。尽管抗血管生成策略已被用于GBM治疗，如贝伐珠单抗（Bevacizumab）等靶向血管内皮生长因子A（VEGFA）的药物在临床试验中并未取得理想效果，被欧洲神经肿瘤协会判定为无效。因此，深入探究肿瘤血管生成机制、寻找能够调控GBM血管生成能力的新型药物具有重要的临床转化价值。

O-乙酰氨基葡萄糖修饰（O-GlcNAcylation）是一种普遍的蛋白质翻译后修饰，由O-乙酰氨基葡萄糖转移酶（O-GlcNAc transferase, OGT）催化形成，并由O-乙酰氨基葡萄糖苷酶（OGA）动态去除。该修饰利用己糖胺生物合成途径（Hexosamine Biosynthetic Pathway, HBP）终产物尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺（UDP-GlcNAc）作为供体底物，将N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）转移至核蛋白、胞质蛋白和线粒体蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基上。由于UDP-GlcNAc的合成依赖于葡萄糖、谷氨酰胺、乙酰辅酶A和UTP，该修饰成为TAOBE作为一种营养感应机制，连接营养可利用性与细胞信号调控。在肿瘤生物学中，O-GlcNAcylation与多种肿瘤类型相关，但研究结果异质性较大。OGA抑制剂Thiamet G（TMG）是一种N-丁基-GlcNAc（NButGT）衍生物，具有更高的稳定性和水溶性，可口服给药并能透过血脑屏障，已在多种癌症模型中显示出治疗潜力。

本研究发表于《Journal of Molecular Biology》，研究人员首次系统探究了TMG对GBM分泌组AngioMatrix特征的调控作用及其功能意义，为GBM抗血管生成治疗提供了新的药理学靶点。

该研究主要运用了以下关键技术方法：无标记质谱技术（label-free mass spectrometry）进行分泌组蛋白鉴定与定量；纳米颗粒追踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）评估分泌组囊泡特征；STRING数据库、基因本体论（Gene Ontology, GO）分类和REACTOME数据库进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络及通路富集分析；Matrisome分类系统（Matrisome Analyzer工具）进行细胞外基质蛋白分类；基于TCGA-GBM（287例）、CPTAC-3（195例）和HCMI-CMDC（57例）的癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）数据整合分析患者基因组和转录组信息；活细胞显微镜实时成像结合TrackMate插件分析内皮细胞迁移参数；管腔形成实验结合Angiogenesis Analyzer插件评估血管生成能力；实时荧光定量PCR（qPCR）验证基因表达变化。

研究结果部分：

Thiamet G处理在计算机中富集GBM分泌组的ECM相关通路并将蛋白质-蛋白质网络重连至ECM蛋白聚糖与弹性纤维形成信号通路簇

研究人员首先排除了TMG处理对GBM细胞分泌/囊泡化速率的影响，NTA分析显示两组间囊泡浓度和平均粒径无显著差异。无标记质谱鉴定出对照分泌组136种蛋白、TMG处理组103种蛋白，两组共有672种蛋白，其中52种呈现显著倍数变化。STRING PPI分析显示蛋白间相互作用显著高于随机集合。REACTOME通路分析表明，TMG处理组分泌组中ECM相关信号通路显著富集，包括细胞外蛋白聚糖（Extracellular Proteoglycans）、弹性纤维形成（Elastic Fiber formation）、胶原形成（Collagen formation）和ECM降解（Degradation of the ECM）四大通路。具体而言，在ECM蛋白聚糖通路中，层粘连蛋白α5（LAMA5）、转化生长因子β1（TGFβ1）和整合素αV（ITGAV）显著上调，核心蛋白聚糖（DCN）仅见于对照组，而整合素α2（ITGA2）、纤调蛋白（FMOD）、整合素β3（ITGB3）和双糖链蛋白聚糖（BGN）仅见于TMG组。弹性纤维形成通路中，TGFβ1和ITGAV显著上调，纤蛋白-5（FBLN5）、弹性蛋白微丝界面蛋白2（EMILIN2）、潜伏TGFβ结合蛋白1（LTBP1）和ITGB3仅见于TMG组。胶原形成通路中，基质金属蛋白酶9（MMP9）、基质金属蛋白酶3（MMP3）和LAMA5显著上调。ECM降解通路中，MMP9、MMP3和LAMA5显著上调。DBSCAN聚类分析揭示TMG组形成了对照组中不存在的两个新聚类：ECM蛋白聚糖和弹性纤维形成。这些结果表明TMG处理通过富集并重连ECM相关通路，破坏了GBM分泌组的分子特征。

Thiamet G处理在计算机中破坏GBM分泌组的基质组分子特征，富集核心基质组蛋白中的糖蛋白、调控因子、附属蛋白、分泌因子和胶原类别

基于Matrisome分类系统的进一步分析显示，TMG处理组分泌组中Matrisome特征蛋白比例从对照组的17.9%升至19.9%。核心Matrisome蛋白占比从8%升至9.4%，Matrisome相关蛋白占比从10%升至10.5%。具体类别分布为：对照组核心Matrisome中胶原占7.6%、ECM糖蛋白占32.6%、蛋白聚糖占4.2%；TMG组中胶原占7.8%、ECM糖蛋白占34.4%、蛋白聚糖占5.2%。Matrisome相关蛋白中，对照组ECM调控因子占29.9%、ECM附属蛋白占13.2%、分泌因子占12.5%；TMG组中ECM调控因子占29.2%、ECM附属蛋白占11.7%、分泌因子占11.7%。136种共有Matrisome特征蛋白中，9种显著增加（LAMA5、THBS2、MMP3、MMP9、SEMA7A、LGALS1、TGFB1、CCL2），4种显著减少（IGFBP3、SERPINA1、COL12A1、IL-6）。TCGA数据分析显示Matrisome基因存在破坏性错义突变、拷贝数变异（CNV）增益/缺失以及异常基因表达，但与患者预后关系异质性较大。

基质组基因在GBM和低级别胶质瘤（Low Grade Glioma, LGG）患者中呈现与有害/破坏性错义突变、CNV增益/缺失及异常基因表达相关的变异，并与异质性预后相关

研究人员对553例GBM患者和513例LGG患者的TCGA数据进行了分析。HMCN1是两队列中突变频率最高的Matrisome基因（GBM 7.41%，LGG 3.7%）。GBM队列中检测到253种Matrisome基因突变，LGG队列中102种。HMCN1、LAMA5、PAPPA2、COL12A1突变数最高，错义变异最为常见。GBM队列中76种（30%）、LGG队列中38种（37.2%）变异具有高Polyphen评分，提示高度有害/破坏性。SEMA3C、IL6、IGFBP3和LAMA5在两队列中CNV增益最高。SERPINA1和FBLN5在两队列中CNV缺失最高。RNA-seq分析显示SERPINA1、LGALS1、IGFBP3、TGFβ和CCL2基因表达与GBM患者总生存期显著负相关，LGG患者中仅CCL2基因表达与总生存期显著负相关。

Thiamet G处理在计算机中破坏GBM分泌组的血管生成特征分子特征

研究人员利用GO分类系统筛选出6种血管生成相关生物学过程：血管生成、血管生成调控、血管生成负调控、出芽式血管生成、血管生成正调控以及出芽式血管生成中的细胞迁移。分析显示68种蛋白为GBM分泌组的血管生成特征蛋白。TCGA数据分析显示98种GBM患者血管生成相关基因变异和86种LGG患者变异，其中40.8%和45.3%具有高Polyphen评分。THBS2和NRCAM为GBM队列中显著改变的基因，NRCAM和ITGAV为LGG队列中显著改变的基因。仅ITGAV基因表达下调与LGG患者较长总生存期相关。

Thiamet G处理破坏GBM分泌组的血管基质特征并在计算机中显著改变THBS2、CCL2和IL-6的丰度

将Matrisome特征与血管生成特征合并后，研究人员鉴定出25种蛋白构成的AngioMatrix特征蛋白，其中THBS2和CCL2显著上调，IL-6显著下调。DBSCAN聚类分析显示这些蛋白形成7个不同的信号通路簇。与LGG患者相比，GBM患者中THBS2、CCL2和IL6的CNV增益和杂合缺失比例更高。THBS2基因突变与GBM患者较短总生存期相关，但基因表达水平无显著影响。CCL2基因表达与GBM和LGG患者总生存期均呈显著负相关，而基因突变无显著相关性。IL-6基因表达和突变与两队列总生存期均无显著相关性。

OGA活性抑制通过Thiamet G在体外损伤内皮细胞迁移和管腔形成

为验证计算机分析结果，研究人员进行了体外功能实验。活细胞成像显示，暴露于TMG处理GBM分泌组的人脑微血管内皮细胞（HBMEC）的最大速度、最小速度和平均速度均显著降低。管腔形成实验显示TMG处理组呈现异常管腔形成模式，网格面积、节段数、连接点数、主连接点数、主节段数和连接点数量均显著减少。细胞毒性检测确认48小时内无显著毒性。进一步qPCR验证显示TMG处理不影响IL6、VEGFa和CCL2基因表达，但显著下调THBS2基因表达（倍数变化=0.3，p=0.04）。这些结果提示TMG通过非VEGFa依赖方式破坏GBM分泌组的血管生成调控能力。

讨论部分总结：

研究人员在讨论中深入阐释了TMG调控GBM分泌组AngioMatrix特征的分子机制及其功能意义。ECM在GBM行为调控中发挥关键作用，影响肿瘤增殖、浸润、复发和治疗抵抗。O-GlcNAcylation在GBM肿瘤生物学中的作用尚不明确，本研究为理解该修饰在肿瘤微环境调控中的功能提供了新视角。

关于ECM组分的功能意义，研究人员指出：LAMA5作为血管基底膜组分，虽在体外促进多种肿瘤增殖和转移，但体内研究显示其可抑制GBM U251MG细胞迁移，与本研究中TMG处理分泌组降低内皮细胞迁移和管腔形成的结果一致。TGF-β作为GBM生物学中的关键免疫抑制因子和多功能形态发生素，可通过IGFBP3信号通路增强VEGF等促血管生成蛋白。值得注意的是，TMG处理后IGFBP3显著减少，可能中断了TGF-β的促血管生成信号循环。DCN的缺失可能解释了TGF-β1的代偿性增加。尽管ITGAV和TGF-β1均增加，但由于DCN和IGFBP3的下调，未能产生促血管生成效应。

MMP9在TMG处理后的显著增加具有双重解读：一方面MMP9与肿瘤侵袭转移相关，另一方面其可水解Galectin和TGF-β等底物从而中和其促血管生成效应。研究中鉴定出的TIMP家族成员可能通过抑制MMP9和MMP3活性而减弱ECM重塑的促血管生成影响。

关于AngioMatrix特征蛋白的核心发现：THBS2作为血管生成抑制因子，通过阻断NOTCH信号通路发挥抗血管生成作用。本研究中TMG处理导致THBS2减少，与HBMEC细胞迁移降低和管腔形成异常相吻合，同时MMP2/9水平增加也可能与THBS2降低相关。CCL2作为趋化因子，通过招募调节性T细胞（Treg）抑制抗肿瘤免疫反应并与GBM患者短总生存期相关，其增加可能与MMP9表达正调控有关，但IGFBP3下调可能中断该效应。IL-6通过gp130/JAK/STAT3信号通路上调血管生成基因，其显著减少与分泌组血管生成能力降低一致。

综合IGFBP3和IL-6的减少以及THBS2的增加，研究人员认为TMG处理通过同时下调促血管生成因子和上调血管生成抑制因子，共同阻碍了GBM分泌组的血管生成能力。

研究结论：

本研究通过整合无标记质谱技术、计算机模拟分析和体外验证实验，证明TMG处理显著改变了GBM分泌组的AngioMatrix特征，并导致内皮细胞行为异常。这些结果首次在文献中证明OGA抑制剂具有调控GBM分泌组分子特征的能力，进而影响肿瘤微环境中的关键细胞成分如内皮细胞及其迁移和管腔形成潜能。研究为TMG作为GBM抗血管生成治疗的候选药物提供了理论依据，并为后续体内验证研究指明了方向。