LRP1与裂谷热病毒糖蛋白相互作用的生化基础及其在病毒进入中的作用

《Journal of Molecular Biology》：Biochemical basis for LRP1 interaction with Rift Valley fever virus glycoprotein and its role in viral entry

　　

低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）是裂谷热病毒（RVFV）的宿主进入因子，RVFV属于布尼亚病毒纲（Bunyaviricetes）白纤病毒科（Phenuiviridae）的一种负义RNA病毒。先前的研究表明，RVFV糖蛋白（GnGc）主要与LRP1的簇II（CLII）和簇IV（CLIV）相互作用以促进病毒进入。然而，RVFV GnGc与LRP1结合的机制尚未完全阐明。在本研究中，研究人员成功绘制了单个LRP1配体结合区域（称为CR结构域）的作用，并确定CR25足以实现高亲和力的RVFV GnGc结合。对LRP1多CR与RVFV GnGc结合的分析还揭示了LRP1结合模式的冗余性。CR25内一个关键芳香族残基的突变导致与RVFV GnGc的结合近乎完全丧失，表明CR25在体外与GnGc结合中起关键作用。研究人员进一步评估了这些CR结构域抑制RVFV-MP12^GFP感染的能力，并确定需要两个以上连续的LRP1 CR结构域才能实现体外中和。综上所述，这些结果为LRP1与RVFV GnGc的结合提供了生化基础，并提示类似机制可能在新发和再发病毒（包括布尼亚病毒、甲病毒和黄病毒）的LRP1介导感染中发挥作用。这些结果还突出了截短的LRP1胞外域可用于免疫原设计和治疗靶向。

# 论文解读：LRP1与裂谷热病毒糖蛋白相互作用的生化基础及其在病毒进入中的作用

## 研究背景
裂谷热病毒（Rift Valley Fever Virus, RVFV）是一种有包膜的负义RNA病毒，属于白纤病毒科（Phenuiviridae）白蛉病毒属（Phlebovirus）。RVFV是一种主要经蚊媒传播的人畜共患病毒，在撒哈拉以南非洲、北非和阿拉伯半岛流行，并因蚊虫扩散和人类活动而具有向非流行区传播的高风险。目前针对RVF的人类疫苗和抗病毒对策有限，亟需开发疫苗和治疗方法。RVFV基因组包含小（S）、中（M）、大（L）三个片段，其中M片段编码前体糖多蛋白，经细胞蛋白酶加工为Gn和Gc糖蛋白，形成GnGc异二聚体。RVFV利用GnGc异二聚体复合物进行细胞附着、进入和融合。既往研究已发现低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）是促进RVFV进入的宿主因子，LRP1对SARS-CoV2、奥罗普切病毒（OROV）、登革病毒、发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）、黄热病毒（YFV）等多种病毒的感染也至关重要。然而，RVFV GnGc与LRP1结合的分子机制尚未完全阐明，尤其是LRP1中富含半胱氨酸重复序列（CRs）的单个结构域如何参与结合及其功能冗余性仍不清楚。为此，研究人员开展了本研究，以明确LRP1 CLIV内单个CR域在介导RVFV糖蛋白结合和病毒进入中的作用。

## 研究内容与结论
本研究通过构建LRP1 CLIV的一系列截短蛋白（包括单CR、双CR和四CR结构域），结合生物层干涉测量法（BLI）、体外下拉实验和RVFV-MP12^GFP体外感染中和实验，系统鉴定了CR25作为高亲和力结合RVFV GnGc的关键域，并揭示了多个CR之间的冗余结合模式。突变CR25内保守的关键芳香族残基（W3512）可导致单CR和四CR背景下与GnGc结合近乎完全丧失，但在完整CLIV背景下突变该残基却不影响结合，表明多CR环境中存在互补性。体外感染实验显示，仅单CR或双CR蛋白无法有效中和RVFV感染，而需两个以上连续CR（如四CR或完整CLIV）才能显著抑制病毒进入。AlphaFold3建模进一步预测了CR25与RVFV Gn之间的静电和疏水相互作用界面，并指出在病毒粒子中GnGc异六聚体/异五聚体结构限制下，LRP1 CLIV可能仅与少数CR位点接触。这些结果明确了LRP1与RVFV糖蛋白结合的生化基础，提示类似机制也可能适用于其他依赖LRP1进入的病毒，并为基于截短LRP1胞外域的免疫原设计和抗病毒靶向策略提供了理论基础。该论文发表在《Journal of Molecular Biology》。

## 主要技术方法
研究人员使用了以下关键方法：1）生物层干涉测量法（BLI）——用于定量检测不同CR蛋白与RVFV GnGc或受体相关蛋白（RAP）的结合动力学与亲和力；2）体外下拉实验——通过rProtein A磁珠共沉淀验证蛋白-蛋白相互作用；3）AlphaFold3结构预测——模拟CR25和CR24-28与RVFV Gn的复合物模型，并与近期发表的RVFV GnGc多聚体冷冻电镜结构（PDB 9v6r）进行比较；4）体外感染中和实验与流式细胞术——以小鼠小胶质细胞BV2为靶细胞，用RVFV-MP12^GFP病毒评估不同CR蛋白的抑制效果。样本来源包括Expi293F（GnTI?）细胞（哺乳动物蛋白表达）和E. coli BL21细胞（细菌蛋白表达）。

## 研究结果
### 1. LRP1 CR25单独即可高亲和力结合RVFV GnGc
通过BLI筛选LRP1 CLIV的11个单CR蛋白发现，仅CR25在1000 nM浓度下与RVFV GnGc结合，解离常数（K_D,app）为140 ± 13 nM。下拉实验和热稳定性分析确认了CR25的正确折叠和结合特异性。

### 2. LRP1多CR与RVFV GnGc结合揭示冗余结合模式
双CR蛋白结合分析表明，含CR25的构建体（如CR25-26）亲和力最高（K_D,app = 150 ± 9.1 nM），其他不含CR25的双CR（如CR26-27）结合较弱或不结合。四CR蛋白中，含CR25的CR24-27结合力最强（K_D,app = 280 ± 2.1 nM），而CR21-24和CR28-31结合力低一个数量级；值得注意的是，CR21-24在单CR或双CR水平无结合的情况下仍显示可测量结合，提示多CR组合可产生新的结合能力。

### 3. RAP与LRP1 CLIV和CR的结合偏好与RVFV糖蛋白结合相似
为验证CR蛋白的折叠和功能，研究人员使用另一LRP1配体RAP（受体相关蛋白）进行平行实验。mRAPD3同样仅与CR25单CR结合，双CR中CR25-26结合最强（K_D,app = 94 ± 23 nM），四CR中CR24-27结合最强（K_D,app = 150 ± 43 nM）。RAP与不同CR的结合趋势与RVFV GnGc总体一致，但存在细微差异，体现了CR的配体选择性。

### 4. LRP1 CR结构域足以体外中和RVFV感染
将不同CR蛋白预孵育RVFV-MP12^GFP后感染BV2细胞，流式检测GFP阳性比例。单CR（CR25）和双CR（CR25-26）几乎无抑制效果，而四CR（CR24-27）和完整CLIV则显著抑制感染，且随浓度增加抑制增强（p<0.001）。这表明需要两个以上CR才能实现有效中和。

### 5. LRP1 CR25芳香族残基对结合RVFV GnGc至关重要
基于序列保守性，对CR25中四个保守残基（E3498、W3512、D3515、D3519）进行丙氨酸突变。完全突变体CR25^EWDD/AAAA及单突变W3512A、D3515A、D3519A均导致与GnGc结合丧失，仅E3498A保留部分结合（K_D,app = 600 ± 65 nM）。在感染抑制实验中，所有CR25突变体包括野生型CR25均不能抑制感染，进一步验证了单CR不足以中和病毒。

### 6. LRP1 CR25在孤立条件下可结合GnGc，但在LRP1 CLIV背景下并非必需
将W3512A突变引入四CR（CR24-27）和完整CLIV。CR24-27^W3512A完全丧失与GnGc的结合，而CLIV^W3512A结合亲和力（K_D,app = 77 ± 7 nM）与野生型（88 ± 12 nM）无显著差异。感染抑制实验中突变型与野生型CR24-27和CLIV效果相似，表明在多CR环境中CR25的贡献被其他CR补偿。

### 7. AlphaFold3建模识别可能促进感染的界面
AlphaFold3预测CR25与RVFV Gn的复合物，显示CR25的带电残基（E3498、D3515、E3517、D3518、D3519）与Gn的碱性残基（K378、K395、K411、K412）形成静电相互作用，并由W3512增强疏水接触。将模型与RVFV GnGc六聚体冷冻电镜结构比较发现，CR25在单体或六聚体GnGc中均能结合而无显著空间位阻，但LRP1 CLIV在六聚体背景下与Gn结合时存在明显位阻，提示实际病毒粒子中LRP1仅接触少数CR位点。

## 讨论与结论
本研究通过还原论方法定义了LRP1 CLIV与RVFV糖蛋白结合的分子基础。尽管LRP1各CR之间高度相似，但CR25主导结合出乎意料，揭示了不同CR对病毒糖蛋白结合和感染支持的不同作用。结合RAP实验进一步确认了CR的正确折叠和配体选择性。体外受体阻断实验表明LRP1 CR与RVFV Gn的相互作用具有冗余性和互换性。研究结果支持LRP1 CR域通过静电相互作用（所有LDLR家族成员共通机制）与Gn结合，且需要两个以上CR域才能有效促进病毒进入。这些发现为理解LRP1介导的病毒进入机制提供了重要见解，并为开发抗病毒药物和疫苗免疫原提供了分子框架。论文结论翻译如下：综上所述，这些结果为LRP1结合RVFV GnGc提供了生化基础，并表明类似机制可能在新发和再发病毒（包括布尼亚病毒、甲病毒和黄病毒）的LRP1介导感染中发挥作用。这些结果还突出了截短的LRP1胞外域可用于免疫原设计和治疗靶向。