人中性粒细胞丝氨酸蛋白酶4的新型大环肽作为强效和选择性抑制剂

《Journal of Molecular Biology》：Novel macrocyclic peptides as potent and selective inhibitors of human neutrophil serine protease 4

　　

中性粒细胞丝氨酸蛋白酶4（NSP4）是NSP家族中最古老的成员，该家族包括中性粒细胞弹性蛋白酶、蛋白酶3和组织蛋白酶G，但其独特之处在于强烈偏好切割精氨酸残基之后的肽键。NSP4在髓系前体细胞中高表达，并在肥大细胞成熟过程中调节血管活性组胺的水平。中性粒细胞将活性NSP4储存在嗜天青颗粒中，但其中性粒细胞生物学功能仍未知。为推进对NSP4生物学作用的理解，研究人员旨在通过使用大型mRNA展示文库（每个文库编码多达10¹³种独特的含有天然和非天然氨基酸的大环肽（MCPs））生成强效和选择性抑制剂。文库筛选产生了六种MCPs，它们强烈抑制重组和内源性细胞来源的NSP4活性，但不抑制13种结构相关的蛋白酶。与使用活性基团探针的生物化学研究一致，两种最有效抑制剂MCP-3和MCP-4（K_D分别为6.5 nM和1.0 nM）的晶体结构揭示这些MCPs结合到NSP4活性位点区域。值得注意的是，这两种MCPs在环构象、与活性位点的底物样相互作用以及对水解的抵抗性方面类似于植物来源的向日葵胰蛋白酶抑制剂-1。因此，这些从头生成的MCPs重现了天然丝氨酸蛋白酶抑制剂所使用的标准机制。这项研究凸显了mRNA展示技术在生成强效和高度选择性蛋白酶抑制剂（如本工作中鉴定的大环NSP4抑制剂）方面的能力，这些抑制剂可作为研究这种难以捉摸的蛋白酶生物学功能的宝贵工具。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**

中性粒细胞丝氨酸蛋白酶4（Neutrophil Serine Protease 4，NSP4）是中性粒细胞丝氨酸蛋白酶（Neutrophil Serine Protease，NSP）家族中第四个成员，由基因PRSS57编码。该家族还包括中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和蛋白酶3。与其他三个成员不同，NSP4具有独特的严格精氨酸切割特异性，这是其唯一具有此特性的家族成员。尽管组织蛋白酶G也能切割精氨酸残基之后，但并非严格特异性，更偏向于P1位置含亮氨酸和芳香族残基的底物。NSP4的底物特异性由其独特的活性位点结构决定：其S1口袋被F190和S216残基完全封闭（采用Schechter和Berger命名法及胰凝乳蛋白酶原编号），形成一个浅而不深的疏水沟槽。P1精氨酸残基通过非经典、表面暴露的“上”构象相互作用，由S192、S216和G217形成的氢键网络稳定。这种独特机制使NSP4能容纳修饰的精氨酸残基（如甲基精氨酸和瓜氨酸），区别于其他识别精氨酸的胰蛋白酶折叠丝氨酸蛋白酶。

NSP4在粒细胞-巨噬细胞祖细胞（Granulocyte Macrophage Progenitor cells，GMPs）和骨髓驻留中性粒细胞中高表达，但在GMP分化为成熟肥大细胞过程中表达下调。研究人员前期建立的NSP4敲除小鼠（Prss57^-/-）模型证明NSP4在肥大细胞生物学中起关键作用：NSP4缺失导致肥大细胞分泌颗粒改变，血管活性胺（组胺和血清素）含量减少，从而完全抵抗K/BxN关节炎模型中血清诱导的血管渗漏。然而，NSP4调节组胺和血清素水平的精确机制尚未阐明。在成熟中性粒细胞中，活性NSP4储存在嗜天青颗粒中，但其生理功能仍未知。此外，研究显示NSP4在造血干细胞中的高表达与大鼠多发性硬化（Multiple Sclerosis，MS）表型相关，提示NSP4可能成为MS治疗靶点；蛋白酶抑制剂SPINK2可能以NSP4为靶点，并在骨髓细胞分化中发挥作用。

鉴于NSP4在髓系分化中的作用以及其在中性粒细胞颗粒中以活性酶形式存在，研究人员旨在开发NSP4的强效和选择性抑制剂，作为进一步阐明其生物学的工具试剂。NSP4活性位点的浅而疏水S1位点缺乏传统深S1口袋，使得小分子抑制剂设计困难。大环肽（Macrocyclic Peptides，MCPs）因其受限的环状结构和相对较大的结合表面，成为与NSP4浅活性位点相互作用的理想选择。本研究利用mRNA展示平台，通过遗传密码重编程引入非天然氨基酸，生成含有硫醚键的大环肽文库，以筛选强效选择性NSP4抑制剂。论文发表在《Journal of Molecular Biology》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用了以下关键技术方法：（1）Flexizyme介导的体外翻译系统遗传密码重编程，构建四种编码10-14个氨基酸残基的大环肽库，每个文库含约10¹³种独特肽序列，库中包含天然氨基酸及N-甲基氨基酸、L-高苯丙氨酸等非天然氨基酸；（2）mRNA展示筛选技术：将嘌呤霉素偶联的mRNA文库在体外翻译系统中表达，肽链自发环化形成硫醚键大环，针对生物素化NSP4进行六轮亲和选择（使用中性亲和素包被的磁珠），富集结合序列后通过下一代测序（Next Generation Sequencing，NGS）分析；（3）生化表征：采用荧光底物PK421进行酶活抑制实验，表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）测定结合动力学，活性基团探针（PK401-MeArg-Cy5和PK401-cmk）竞争实验验证活性位点结合；（4）结构生物学：解析NSP4与MCP-4复合物（2.75 ?分辨率）以及催化失活突变体NSP4-S/A与MCP-3复合物（2.1 ?分辨率）的X射线晶体结构；（5）核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）波谱学分析MCP-4在溶液中的构象；（6）质谱法检测MCP的酶解稳定性。研究中使用的样本来源包括：重组NSP4蛋白在Trichoplusia Ni细胞中通过杆状病毒表达系统表达；内源性NSP4来源于人白血病细胞系MOLM-13（该细胞高表达NSP4 mRNA，数据来自Human Protein Atlas）。

**研究结果**

**利用mRNA展示发现靶向NSP4的大环肽：** 研究人员构建了四种高度多样性的肽文库（每种约10¹³种独特肽），编码10-14个氨基酸残基的环肽，其中包含天然和非天然氨基酸，并以N-氯乙酰基-L-苯丙氨酸作为起始氨基酸，L-半胱氨酸作为环化残基。体外翻译后，苯丙氨酸的氯乙酰基与半胱氨酸自发形成硫醚键大环。经六轮针对生物素化NSP4的亲和选择后，与仅含中性亲和素磁珠的反选择相比，NSP4结合MCPs显著富集。根据NGS分析富集分数和序列多样性，从四个文库中选出22种独特大环肽进行化学合成和进一步表征。

**鉴定出强效高选择性的NSP4 MCP抑制剂：** 通过使用NSP4底物PK421的酶活实验筛选22种候选MCP，鉴定出六种MCP（MCP-3、-4、-7、-10、-11和-17）在1 μM浓度下实现超过80%的抑制。这些MCP长度为12-14个氨基酸，其中三种含有非天然氨基酸。IC₅₀值范围为1.4 nM至77 nM。所有六种MCP均可完全抑制NSP4酶活，以最有效的两种抑制剂MCP-3和-4的抑制曲线为例。SPR动力学测定显示IC₅₀与K_D值良好相关，最佳抑制剂MCP-4的IC₅₀为1.4 nM，K_D为1.0 nM。在含有内源性NSP4的人白血病细胞株MOLM-13裂解液的酶活实验中，六种MCP均强烈抑制酶活，而阳性对照抑制剂PK401-MeArg-Cy5也显示抑制。选择性评估显示，在4 μM浓度下，六种MCP对NSP家族其他成员（中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和蛋白酶3）均无抑制；在1 μM浓度下，对另外10种胰蛋白酶折叠丝氨酸蛋白酶（包括尿激酶、血浆激肽释放酶、凝血因子Xa、因子XIa、胰蛋白酶、凝血酶、胰凝乳蛋白酶、肝细胞生长因子活性抑制剂HGF Activator、肝素酶和纤溶酶）均无统计学显著抑制。因此，六种MCP能高选择性地抑制重组和内源性人NSP4。

**研究生化机制以阐明MCP的抑制机理：** 利用两种共价活性位点探针（基于PK401的膦酸酯和氯甲基酮类）进行竞争实验。荧光探针PK401-MeArg-Cy5能强烈标记活性NSP4，但对催化失活突变体NSP4-S/A无标记；六种MCP均抑制PK401-MeArg-Cy5对NSP4的标记，其中MCP-3和-4抑制作用最强，与酶活实验中高效力一致。SPR实验表明，六种MCP不再结合活性位点被PK401-cmk占据的预形成NSP4:PK401-cmk复合物。这些结果表明MCPs结合在NSP4活性位点或其附近。

**MCP-4与NSP4的晶体结构揭示抑制机制和底物样相互作用：** 解析了NSP4与MCP-4复合物的2.75 ?分辨率晶体结构（PDB: 10KV）。整体结构与之前发表的NSP4结构高度相似，包括所有底物特异性环的构象。MCP-4结合在NSP4活性位点，与除140-环外的所有底物特异性环相互作用。MCP-4呈略微扭曲的椭圆形构象，通过Phe1和Ile9侧链的疏水堆积以及四个分子内氢键（包括连接两条反向平行链的两个氢键）稳定。11个MCP-4残基（包括环闭合的硫醚）与NSP4距离在4 ?以内，总埋藏表面积781 ?²。五个关键结合残基（Ala3、Arg5、Arg7、Phe12和Leu13）贡献约70%的总埋藏表面积。MCP-4的一条链沿底物结合裂隙排列，Arg5和Phe12界定了裂隙占据边界。将MCP-4主链残基Phe1-Asp-Ala-Thr-Arg5与HAI-1的Kunitz结构域（KD1）在HGFA复合物中的P3-P2'残基（Arg258-Cys-Arg-Gly-Ser262）进行叠加，显示良好的结构比对，表明MCP-4以底物样方式结合NSP4活性位点，占据相应的S3-S2'亚基。尽管MCP-4含有两个精氨酸，但结构显示两者均不充当真正的P1残基；Ala3作为P1残基仅结合浅S1口袋的一小部分，Arg7的胍基占据S1位点的另一部分，与D-Phe-L-Phe-Arg底物模拟物中的P1精氨酸位置接近，但以不同角度进入。这构成了S1位点的双残基占据。

**MCP-3与催化失活NSP4-S/A的复合物结构显示其重现MCP-4的抑制机制：** 选择催化失活突变体NSP4-S/A（催化丝氨酸突变为丙氨酸）进行结构研究，因其与野生型NSP4相比结合亲和力高约7倍。解析了2.1 ?分辨率的NSP4-S/A:MCP-3复合物晶体结构（PDB: 10KU）。MCP-3结合区域与MCP-4类似，构象几乎相同，唯一差异在于MCP-3的Ile10-Gly11短段因少一个残基而与MCP-4的Phe11-Phe12段偏离。MCP-3序列含有三个连续苏氨酸、四个精氨酸和两个异亮氨酸，其中6个残基与NSP4特异性相互作用，占其总埋藏表面积（724 ?²）的约80%。MCP-3的Phe1-Thr-Thr-Thr-Arg5段（P3-P2'区）同样以底物样方式与催化裂隙相互作用。MCP-3由9个分子内氢键（包括5个水介导的氢键）稳定。与MCP-4类似，S1位点由P1-Thr3和Arg7共同占据，Arg7的胍基与NSP4 Gly217的骨架羰基形成极性相互作用。NSP4-S/A的Ala195与P1残基Thr3紧密接触，解释了MCP-3对野生型NSP4结合亲和力较低的原因。

**MCP-3和MCP-4与天然向日葵胰蛋白酶抑制剂-1（SFTI-1）的相似性：** SFTI-1是一种14个氨基酸的植物来源大环肽，属于Bowman-Birk抑制剂家族。将胰蛋白酶:SFTI-1复合物（PDB: 1SFI）与MCP-3和-4复合物叠加，显示SFTI-1主链构象与MCP-3和MCP-4高度相似（主链RMSD分别为0.93 ?和1.50 ?）。SFTI-1特有的分子内二硫键（Cys3-Cys10）在MCP-3和-4中被对应位置的Phe1和Ile9的疏水堆积所替代。然而，NMR实验表明MCP-4在溶液中不呈现晶体结构中的紧凑环构象，Phe1和Ile9侧链无相互作用，温度系数进一步支持溶液中的柔性环结构。因此，Phe1-Ile9相互作用是结合态特征，而SFTI-1的二硫键赋予溶液构象刚性。此外，P3-P2'残基的底物样相互作用段（SFTI-1的Cys3-Ile7与MCPs的Phe1-Arg5）对齐极好（RMSD<0.3 ?）。尽管以底物样方式呈现，但晶体结构未显示P1-P1'酰胺键切割。质谱分析表明，与等摩尔NSP4在室温孵育24 h后，MCP-3和MCP-4的水解程度较低（分别为20±9%和16±6%），水解产物质量增加18 Da，表明两者高度抵抗酶解，类似SFTI-1和其他天然标准机制抑制剂。尽管具有相似特征，但MCPs和SFTI-1的蛋白酶选择性截然不同：MCPs不抑制胰蛋白酶和组织蛋白酶G（SFTI-1的靶标），而SFTI-1抑制胰蛋白酶但不抑制NSP4。

**讨论与结论**

本研究报道了mRNA展示衍生的大环肽作为NSP4的强效高选择性抑制剂。两种最有效的MCPs（MCP-3和-4）的结构分析揭示了底物样活性位点结合模式，并与几乎所有MCP残基形成的扩展相互作用表面（接近抗体表位）。这些抑制剂从单次MCP文库筛选中获得，未经序列优化。与从头设计文库通常预期不遵循标准（Laskowski）机制不同，本研究的从头组合文库产生的MCPs以底物模拟方式结合NSP4活性位点，类似于天然抑制剂如Kunitz结构域和Bowman-Birk抑制剂。这可能是由于文库的高度多样性（约10¹³）和单环肽的大尺寸和柔性（最多14聚体）有利于形成能催化裂隙的延伸肽段。MCP-3和-4在整体构象、底物样活性位点相互作用和抗水解性方面与天然抑制剂SFTI-1惊人相似。两者的S1位点占据方式独特：P1残基（Thr3或Ala3）和Arg7共同占据浅S1口袋，反映了NSP4活性位点缺乏经典深S1口袋的结构特征。其他四种鉴定出的MCP可能具有不同的结合模式（如MCP-10可能使P1-Arg单独占据S1位点），但需结构验证。

**研究结论：** 这些发现说明了从头大环肽如何重现天然抑制机制，同时达到天然抑制剂中罕见的专一性水平。本研究中描述的靶向NSP4的MCPs可作为有价值的研究工具，用于探索这种知之甚少的蛋白酶在人类疾病中的生物学功能及其潜在作用。