促甲状腺激素(TSH)促进原代大鼠室管膜细胞内chemerin/CMKLR1–cAMP/ERK–Ⅱ型碘甲腺原氨酸脱碘酶(DIO2)信号通路

《Journal of Molecular Endocrinology》：TSH promotes chemerin/CMKLR1–cAMP/ERK–DIO2 signaling in primary rat ependymal cells in vitro

　　

在哺乳动物中，chemerin及其受体CMKLR1可能是大鼠第三脑室室管膜细胞响应长光照周期的下游效应分子。Ⅱ型碘甲腺原氨酸脱碘酶(DIO2, type 2 iodothyronine deiodinase)是促甲状腺激素(TSH, thyroid-stimulating hormone)参与光周期信号传导的主要产物。因此，TSH与chemerin/CMKLR1信号之间可能存在潜在相互作用共同参与光周期变化调控。本研究旨在探讨chemerin/CMKLR1信号能否刺激DIO2生成，以及TSH如何影响原代大鼠室管膜细胞中chemerin/CMKLR1信号。采用免疫组织化学法观察chemerin与其受体CMKLR1的共定位；分别通过实时荧光定量PCR(real-time PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)鉴定chemerin和CMKLR1的表达；通过Western blot和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测涉及双重信号通路（cAMP水平升高及细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)磷酸化）的DIO2表达。研究结果显示原代大鼠室管膜细胞中chemerin与CMKLR1存在潜在相互作用。TSH可上调chemerin预处理的原代室管膜细胞中chemerin和CMKLR1的表达。体外用chemerin(10 ng/mL)或TSH(60 mIU/mL)处理原代室管膜细胞，均可诱导cAMP水平升高、ERK1/2磷酸化及DIO2表达增加。此外，研究人员发现TSH可通过升高cAMP水平及促进ERK1/2磷酸化，增强chemerin/CMKLR1信号对DIO2生成的促进作用。研究人员得出结论：chemerin/CMKLR1信号可在体外增强原代大鼠室管膜细胞中DIO2活性，且该效应可被TSH通过cAMP和ERK1/2磷酸化进一步促进。

本文发表于《Journal of Molecular Endocrinology》，以下为论文解读：

【研究背景与立题依据】

室管膜细胞(ependymal cells)衬于下丘脑第三脑室，其中含有特化的伸展细胞(tanycytes)，表达促甲状腺激素受体(TSHR)。已有研究表明，光周期变化通过TSH–cAMP/ERK信号调控室管膜层Ⅱ型碘甲腺原氨酸脱碘酶(DIO2, type 2 iodothyronine deiodinase)表达，从而调节局部甲状腺激素(TH, thyroid hormone)活化。在先前的在体研究中，长光照周期可上调第三脑室室管膜层chemerin（由Rarres2基因编码）及其高亲和力G蛋白偶联受体CMKLR1(ChemR23)的表达，提示其为光周期信号的下游效应分子。然而，chemerin/CMKLR1信号在原代室管膜细胞中的功能尚不明确，TSH是否与该信号轴存在交互作用亦未见报道。鉴于TSH和chemerin/CMKLR1各自均可通过cAMP和ERK1/2磷酸化发挥作用，研究人员假设二者存在协同效应共同调控DIO2，并开展本研究验证此假说。

【主要技术方法概括】

研究人员分离培养原代大鼠室管膜细胞(primary rat ependymal cells, PECs，购自Cellverse公司)，经波形蛋白(vimentin)免疫荧光鉴定纯度。实验分组为：对照组(DMSO)、chemerin(10 ng/mL，48 h)、TSH(60 mIU/mL，先DMSO预孵12 h后加TSH共36 h)、chemerin预孵12 h+TSH共处理36 h(chemerin+TSH组)；部分实验采用慢病毒介导的小干扰RNA(siRNA)敲低CMKLR1。采用免疫荧光染色观察chemerin与CMKLR1共定位；real-time PCR检测Rarres2 mRNA；Western blot检测CMKLR1、磷酸化ERK(p-ERK)、总ERK、DIO2及内参GAPDH；ELISA检测胞内cAMP浓度；数据以均值±标准误表示，采用双因素或三因素方差分析(ANOVA)及Tukey事后检验进行统计学比较(n=3次独立实验)。

【研究结果】

TSH promotes chemerin/CMKLR1 expression in primary rat ependymal cells in vitro

免疫荧光显示chemerin(绿色)与CMKLR1(红色)在原代室管膜细胞膜上共定位。Western blot及real-time PCR结果显示，chemerin+TSH共处理组Rarres2 mRNA及CMKLR1蛋白表达显著高于单独chemerin组或单独TSH组(P<0.01)，而单独TSH组与单独chemerin组CMKLR1表达相当。表明TSH可促进chemerin预处理的原代室管膜细胞中chemerin(Rarres2)及CMKLR1的表达。

TSH promotes DIO2 expression by chemerin signaling through the cAMP/ERK pathway in PECs

Western blot显示chemerin+TSH组p-ERK1/2、波形蛋白(vimentin)及DIO2蛋白表达显著高于单独chemerin组或单独TSH组(P<0.01)。ELISA结果显示chemerin+TSH组cAMP浓度也高于两单独处理组(P<0.01)。单独chemerin或单独TSH亦可诱导cAMP升高、ERK1/2磷酸化及DIO2表达上调。表明chemerin与TSH均可通过cAMP/ERK通路诱导DIO2表达，且TSH可协同增强chemerin/CMKLR1信号对DIO2的诱导效应。

CMKLR1 knockdown diminished DIO2 expression by chemerin and TSH in PECs

用siRNA敲低CMKLR1后，chemerin单独处理或chemerin+TSH共处理所引起的p-ERK、DIO2上调及cAMP升高均被显著阻断(P<0.01)，而乱序siRNA(scramble)对照组无此抑制。证实chemerin/CMKLR1受体是该信号轴激活cAMP/ERK及诱导DIO2表达的必需环节，TSH对DIO2的促进作用亦依赖于chemerin/CMKLR1信号。

【讨论与结论翻译】

本研究首次证明TSH可促进原代大鼠室管膜细胞中Rarres2 mRNA及CMKLR1受体的表达，并与chemerin协同增强chemerin–CMKLR1相互作用。chemerin/CMKLR1信号通过cAMP水平升高及ERK1/2磷酸化促进DIO2表达，而TSH可进一步增强chemerin/CMKLR1信号对DIO2生成的诱导作用。虽然既往文献报道CMKLR1在其他细胞类型中偶联Gi/o蛋白并抑制cAMP，但在原代室管膜细胞中chemerin(联合TSH)引起cAMP升高，提示chemerin/CMKLR1信号转导具细胞类型特异性。尚需在体内模型中进一步验证TSH与chemerin/CMKLR1轴的相互作用及具体胞内串话(crosstalk)机制。综上所述：TSH在原代大鼠室管膜细胞中上调chemerin及CMKLR1表达，并促进chemerin/CMKLR1信号通过cAMP和ERK1/2磷酸化增强DIO2活性。