基于RANKL/OPG信号轴的褪黑素调控骨质疏松症的分子机制

《Journal of Molecular Endocrinology》：The molecular mechanism of melatonin in regulating osteoporosis based on the RANKL/OPG signaling axis

　　

褪黑素是改善绝经后女性骨量的潜在药物。本研究考察了褪黑素调控成骨细胞分化的机制。研究人员采用褪黑素处理小鼠胚胎成骨前体MC3T3-E1细胞，或转染组织蛋白酶D（CTSD）载体；并通过H₂O₂处理建立细胞模型。随后进行碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红S染色。研究人员通过卵巢切除术（OVX）建立骨质疏松小鼠模型，并给予褪黑素处理或转染CTSD敲低载体。采用骨生物力学检测评估骨强度；评估骨组织学损伤；通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察破骨细胞分化；通过免疫组织化学检测骨钙素（OCN）和Ⅰ型胶原α1链（COL1A1）表达；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清骨转换标志物Ⅰ型前胶原N端前肽（PINP）和Ⅰ型胶原C端交联端肽（CTX-1）水平。采用蛋白质印迹法（western blotting）检测核因子κB受体活化因子配体（RANKL）、骨保护素（OPG）、Wnt3a和β-catenin蛋白水平。褪黑素处理或CTSD过表达均促进MC3T3-E1细胞中的ALP活性和矿化。褪黑素上调CTSD表达。褪黑素处理增强OVX小鼠骨强度，抑制破骨细胞分化，增加OCN和COL1A1表达，提高PINP水平，并降低CTX-1水平。此外，褪黑素抑制RANKL表达，并促进OPG、Wnt3a和β-catenin表达。CTSD敲低消除了褪黑素对MC3T3-E1细胞和OVX小鼠的调控作用。总之，褪黑素通过增加CTSD表达，促进成骨细胞分化并调控RANKL/OPG/Wnt信号通路，从而延缓骨质疏松症进展。

该文发表于《Journal of Molecular Endocrinology》，围绕绝经后骨质疏松症的分子干预机制展开。骨质疏松症是一种以骨转换增加、骨量降低和脆性骨折风险升高为特征的全身性骨骼疾病，绝经前后女性尤为高发。现有抗骨吸收与促骨形成药物虽可改善骨代谢，但个体疗效差异明显，且存在较严重不良反应风险，因此开发更安全、作用机制更明确的新型干预策略具有重要现实意义。褪黑素作为调节睡眠和昼夜节律的中枢激素，近年来被证实兼具促成骨、抑破骨、抗氧化和改善骨微环境等作用，但其在高剂量条件下对OVX诱导骨质疏松的成骨促进机制仍不清楚。与此同时，组织蛋白酶D（CTSD，一种溶酶体天冬氨酸蛋白酶）被鉴定为骨质疏松中下调的枢纽基因，但其在骨质疏松发生发展中的具体调控作用尚未充分阐明。基于此，研究人员聚焦“褪黑素–CTSD”这一潜在调控轴，旨在明确褪黑素是否通过上调CTSD促进成骨细胞分化，并进一步经由RANKL/OPG与Wnt/β-catenin信号通路减缓骨质疏松进程。

在技术路径上，研究人员分别构建了体外与体内研究体系。体外部分采用小鼠胚胎成骨前体MC3T3-E1细胞，以H₂O₂诱导氧化应激损伤模型，并结合褪黑素处理、CTSD过表达和CTSD敲低干预；通过CCK-8、ALP染色、茜素红S染色、RT-qPCR和western blotting评价细胞活性、成骨分化与分子表达。体内部分采用8周龄雌性C57BL/6J小鼠建立OVX骨质疏松模型，样本分为sham组、OVX组、OVX + MT组和OVX + MT + sh-CTSD组；通过AAV尾静脉转染实现CTSD敲低，并采用micro-CT、三点弯曲生物力学试验、H&E染色、TRAP染色、免疫组织化学及血清ELISA综合评估骨量、骨微结构、骨强度与骨转换状态。

在结果部分，论文首先以“Melatonin increases the mineralization capacity and ALP activity of osteoblasts”为题，说明褪黑素可促进成骨细胞分化。研究显示，在低于100 μM范围内，褪黑素对MC3T3-E1细胞增殖无明显影响，提示该浓度范围内不存在显著细胞毒性。在H₂O₂诱导的损伤条件下，ALP染色与茜素红S染色均表明褪黑素能够剂量依赖性逆转氧化应激导致的ALP活性下降与矿化结节减少，说明褪黑素在体外具有明确的促成骨分化效应。

其次，在“CTSD enhances the mineralization capacity and ALP activity of osteoblasts”部分，研究人员验证了CTSD本身对成骨表型的调节作用。通过转染CTSD过表达载体和敲低载体，并结合RT-qPCR与western blotting确认转染有效后发现，CTSD过表达可显著减轻H₂O₂对MC3T3-E1细胞成骨矿化和ALP活性的抑制，而CTSD敲低则进一步加重这种抑制。该结果表明，CTSD在成骨细胞分化过程中具有促进作用，并提示其可能是骨质疏松干预中的关键分子节点。

在“Melatonin targets CTSD to promote osteoblast differentiation”部分，论文进一步建立了褪黑素与CTSD之间的功能关联。数据库预测提示褪黑素可能作用于CTSD。后续实验证实，在H₂O₂刺激条件下，褪黑素可剂量依赖性上调CTSD的mRNA和蛋白表达。当研究人员在MC3T3-E1细胞中敲低CTSD后，再给予100 μM褪黑素处理，褪黑素对ALP活性与矿化能力的促进作用被显著逆转。这一结果说明，CTSD是褪黑素促进成骨细胞分化所依赖的重要介导因子。

在“Melatonin targets CTSD to alleviate osteoporosis and increase bone strength in OVX mice”部分，研究人员将该机制推进至体内验证。OVX后小鼠股骨中CTSD表达下降，而褪黑素处理可恢复其表达；在AAV介导的CTSD敲低背景下，这种恢复效应被削弱。micro-CT及三维重建结果显示，OVX导致远端股骨松质骨明显丢失，而褪黑素可改善骨小梁结构。定量分析进一步证实，褪黑素提高骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数目（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th），降低骨小梁分离度（Tb.Sp）和结构模型指数（SMI）。与此同时，三点弯曲试验表明，褪黑素增强了股骨极限载荷、极限位移、断裂能、刚度、弯曲应力与弯曲应变。CTSD敲低会使上述骨量和力学改善作用基本消失，说明褪黑素增强骨强度、减轻OVX骨质疏松的体内效应依赖CTSD。

在“Melatonin targets CTSD to inhibit bone loss and reduce bone turnover in OVX mice”部分，论文从骨吸收和骨形成两个方面评估了骨重塑状态。TRAP染色显示，OVX小鼠股骨切片中的TRAP阳性面积增加，提示破骨细胞活性增强；褪黑素处理后TRAP阳性面积下降，说明其抑制破骨细胞分化。免疫组织化学结果表明，OVX组OCN与COL1A1阳性表达减少，提示成骨细胞活性受损，而褪黑素显著提高两者表达，说明成骨功能得到恢复。血清学方面，OVX小鼠成骨标志物PINP下降、骨吸收标志物CTX-1升高；褪黑素则提升PINP并降低CTX-1，提示其可降低高转换状态并重建骨代谢平衡。CTSD敲低同样削弱了这些作用，进一步支持CTSD在褪黑素抗骨质疏松作用中的关键地位。

在“Melatonin targets CTSD to regulate the RANKL/OPG/Wnt signaling pathway”部分，研究人员解析了下游信号机制。无论在H₂O₂处理的MC3T3-E1细胞还是OVX小鼠中，均观察到RANKL表达升高、OPG表达降低，以及Wnt3a和β-catenin表达下降，提示RANKL/OPG失衡和Wnt/β-catenin信号受抑。褪黑素处理后，RANKL被抑制，OPG、Wnt3a和β-catenin表达上升，表明其可同时纠正破骨相关信号与促成骨信号。更重要的是，CTSD敲低消除了褪黑素对这些信号分子的调控效应，说明CTSD位于褪黑素调节RANKL/OPG/Wnt信号网络的重要上游位置。基于这些结果，论文提出褪黑素通过上调CTSD，协调抑破骨与促成骨两方面作用，从而延缓骨质疏松进展。

讨论部分强调，褪黑素与现有抗骨吸收或促骨形成治疗类似，能够直接影响骨重塑，但其优势在于兼具调节骨细胞分化与改善骨组织微环境的双重作用。研究结合既往证据指出，RANKL/OPG平衡对维持骨稳态至关重要，而Wnt/β-catenin信号是促进成骨分化的核心通路之一。本研究结果与既有认识一致，并进一步补充了CTSD这一新的关键分子。论文认为，雌激素缺乏引起的活性氧（ROS）升高与炎症环境恶化，会抑制成骨并促进破骨；CTSD作为溶酶体蛋白水解活性的关键蛋白酶，可能通过维持自噬-溶酶体功能、减轻氧化应激与炎症损伤参与这一过程。研究中CTSD过表达促进成骨、CTSD敲低抵消褪黑素效应的结果，支持了“褪黑素通过上调CTSD发挥骨保护作用”的结论。作者同时指出，本研究动物实验仅采用较高剂量褪黑素，且尚未通过表面等离子体共振或分子对接等方法进一步证明CTSD是否为褪黑素直接靶点；此外，Wnt信号在该过程中的特异调节方式仍需进一步明确，因此对相关机制的解释应保持审慎。

从研究意义来看，该研究不仅证明高剂量褪黑素在OVX骨质疏松模型中具有改善骨微结构、增强骨强度、促进成骨与抑制骨吸收的综合作用，还揭示了其通过CTSD调控RANKL/OPG/Wnt信号通路的分子机制，扩展了褪黑素抗骨质疏松作用的理论基础。研究同时提示，CTSD本身也可能成为骨质疏松治疗的新型分子靶点，对于理解成骨调控、优化绝经后骨质疏松干预策略具有重要价值。

研究结论部分可译为：总之，褪黑素通过增加CTSD表达，促进成骨细胞分化并调控RANKL/OPG/Wnt信号通路，从而延缓骨质疏松症的进展。本研究揭示了褪黑素减缓骨质疏松的新机制，巩固了褪黑素作为抗骨质疏松治疗手段的理论依据。此外，靶向CTSD也可能构成对抗骨质疏松的一种治疗策略。